基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法技术

本发明专利技术共公开了一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。该自杀型质粒的构建包括如下步骤：以pCat‑marinerr质粒为模板进行PCR扩增，将获得的扩增产物作为质粒骨架；然后以pUC57‑tpm质粒为模板扩增tpm抗性基因，再将质粒骨架和tpm抗性基因进行同源重组，得到所述自杀型质粒。本发明专利技术中的耐药突变菌株是将自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，然后将获得菌株和目标菌株混合培养，再用含有亚碲酸盐的单药板、以及含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的双药板进行筛选，得到耐药突变菌株。本发明专利技术方法操作简单，可高通量的获得转座突变株，适用于构建耐药菌株或筛选药物。

Construction of suicide plasmid and drug-resistant mutant strain based on mariner transposon

【技术实现步骤摘要】
基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。
技术介绍
细菌耐药性的产生已成为一个令人担忧的问题，耐药细菌越来越多地出现在动物身上，也越来越多地出现在世界各地的人类身上。某些细菌几乎对所有临床药物都耐药，主要是细菌通过水平传播或者垂直传播或自身基因突变获得某些耐药基因。例如基因编码的抗广谱头孢菌素使得细菌可以耐碳青霉烯，基因编码的16srRNA甲基化酶赋予细菌抵抗氨基糖甙类药物的能力，质粒介导的耐喹诺酮(PMQR)基因赋予细菌耐氟喹诺酮类药物的能力。mcr基因赋予细菌抵抗多粘菌素类药物的能力。基因赋予细菌抵抗某种药物的能力，世界范围类已经发现许多耐药基因。然而，随着细菌进化，许多新型耐药基因尚待挖掘。因此，发现新基因，研究细菌进化特点迫在眉睫。研究新基因，现有的方法只要有基因敲除，这种方法主要是失活目标基因，从而研究目标基因失活以后细菌表型的变化，从而探究目标基因的功能。该方法是可以用来敲除靶基因，但对于在偌大的细菌染色体组寻找靶基因无异于大海捞针。此外，测序技术的兴起，也为研究新基因提供了新的武器。但是测序技术成本昂贵，测序技术可以用来比较基因序列的同源性，但是对于研究某些差异比较大的亚型，效果不好，且对技术人员要求很高。原核生物和真核生物基因组中存在着一种可以在基因组中移动的DNA序列，被称为转座子。转座子是基因组内相对独立的、可移动序列，他们不必借助质粒或噬菌体形式就可以从一个位置“跳跃”到另一个位置，从而产生基因突变(Slotkinetal.,2007)。早在1951年美国遗传学家BarbaraMclintock在研究玉米的过程中发现了可移动的DNA转座子，之后又陆陆续续在细菌、真菌以及一切生物中发现了转座子，转座子的发现说明了基因在染色体上的位置并非是固定的(Medhoraetal.,1988)。转座子有以下几个特点：1、转座子是基因组的正常组成成分，不独立存在；2、转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个位置直接转移到另一个部位；3、转座随机发生；4、转座子插入引起基因重排使得物种进化。由于转座引起基因的重排使得转座子成为各种生物基因分析的有效工具。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法。本专利技术的另一目的在于提供所述基于mariner转座子构建得到的自杀型质粒。本专利技术的再一目的在于提供所述自杀型质粒在构建耐药突变菌株中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法，包括如下步骤：(1)以pCat-marinerr质粒为模板，以序列at-F和CatR为引物，进行PCR扩增，得到扩增产物(作为质粒骨架)；其中，at-F和CatR的核苷酸序列如下所示：at-F:5’-ccagaactcatgttgcatggtat-3’；CatR:5’-ccaagttctgaGCCTTTTTGCG-3’；(2)以pUC57-tpm质粒为模板，以序列TPM-F和TPM-R为引物，进行PCR扩增，得到tpm抗性基因；其中，TPM-F和TPM-R的核苷酸序列如下所示：TPM-F:5’-tcagaacttggcagtgagtatcca-3’；TPM-R:5’-atgcaacatgagttctggcat-3’；(3)将步骤(1)中得到的扩增产物和步骤(2)中得到的tpm抗性基因进行同源重组，得到pTPM-XY质粒，即所述基于mariner转座子构建的自杀型质粒。步骤(1)中所述的扩增产物的大小为3443bp。步骤(2)中所述的pUC57-tpm质粒优选为由擎科生物科技有限公司合成的含有tpm基因的pUC57-tpm质粒。步骤(3)中所述的同源重组为采用同源重组试剂盒进行同源重组；优选为采用南京诺唯赞生物科技有限公司的同源重组试剂盒OnestepcloningKit进行同源重组。一种自杀型质粒，通过上述任一项所述的方法构建得到。所述的自杀型荧光质粒在构建荧光菌株中的应用。一种基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，包括如下步骤：(A)将上述自杀型质粒(即pTPM-XY质粒)转化大肠杆菌WM3064(E.coliWM3064)感受态细胞，得到大肠杆菌WM3064/pTPM-XY；(B)将大肠杆菌WM3064/pTPM-XY和目标菌株分别培养至对数生长期；(C)将对数生长期的大肠杆菌WM3064/pTPM-XY和目标菌株按体积比1：1～10混合均匀后加入到培养基中进行培养，得到含有细菌的培养液；(D)将含有细菌的培养液涂布到含有亚碲酸盐的平板上继续培养，然后挑取单菌落同时接种到单药板和双药板上，再挑选双药板上不生长而单药板的菌生长的菌株，得到突变菌株，即所述基于mariner转座突变技术构建的耐药突变菌株；其中，单药板为含有亚碲酸盐的平板，双药板为含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的平板。步骤(A)中所述的大肠杆菌WM3064(E.coliWM3064)感受态细胞通过CaCl2法制得；优选为通过如下方法制备得到：(I)将大肠杆菌WM3064接种到含有二氨荃庚二酸(DAP)的LB肉汤培养基进行活化培养，然后转接到含有二氨荃庚二酸(DAP)的LB肉汤培养基进行扩大培养，再在冰上预冷后于4℃条件下进行离心，弃上清，得到大肠杆菌菌液；(II)将预冷的CaCl2溶液加入到步骤(I)中得到的大肠杆菌菌液中，混匀后于4℃条件下进行离心，弃上清，再加入预冷的含15％(v/v)甘油的CaCl2溶液，重悬细菌，冰上放置，得到大肠杆菌WM3064感受态细胞。步骤(I)中所述的LB肉汤培养基中的二氨荃庚二酸的浓度为50μg/ml。步骤(I)中所述的活化培养的条件优选为：37℃过夜培养。步骤(I)中所述的扩大培养的条件优选为：37℃培养2～3h。步骤(I)中所述的冰上预冷的时间优选为10min。步骤(I)中所述的离心的条件优选为：4000g离心15min。步骤(II)中所述的CaCl2溶液与大肠杆菌菌液的体积比为0.2:1。步骤(II)中所述的离心的条件优选为：4000g离心10min。步骤(II)中所述的冰上放置的时间优选为10min。步骤(II)中所述的大肠杆菌WM3064感受态细胞的保存温度优选为-80℃。步骤(A)中所述的转化优选为通过如下步骤实现：(i)将自杀型质粒(pTPM-XY质粒)加入到大肠杆菌WM3064感受态细胞中，混匀后冰浴30min、42℃水浴45s、冰浴3min，再加入含有二氨荃庚二酸的培养基进行培养，得到菌液；(ii)将步骤(i)中得到的菌液涂布在含有二氨荃庚二酸和亚碲酸钠的培养基中进行培养，得到转化成功的WM3064/pTPM-XY，即荧光标记的大肠杆菌WM3064/pTPM-XY。步骤(i)中所述的自杀型质粒(pTPM-XY质粒)与大肠杆菌WM3064感受态细胞的体积比优选为1:10。步骤(i)中所述的培养的条件优选为：37℃培养1h。步骤(i)中所述的培养基中的二氨荃庚二酸的浓度为50μg/ml。步骤(i)中所述的培养基优选为SOB培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以pCat‑marinerr质粒为模板，以序列at‑F和CatR为引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；其中，at‑F和CatR的核苷酸序列如下所示：at‑F:5’‑ccagaactcatgttgcatggtat‑3’；CatR:5’‑ccaagttctgaGCCTTTTTGCG‑3’；(2)以pUC57‑tpm质粒为模板，以序列TPM‑F和TPM‑R为引物，进行PCR扩增，得到tpm抗性基因；其中，TPM‑F和TPM‑R的核苷酸序列如下所示：TPM‑F:5’‑tcagaacttggcagtgagtatcca‑3’；TPM‑R:5’‑atgcaacatgagttctggcat‑3’；(3)将步骤(1)中得到的扩增产物和步骤(2)中得到的tpm抗性基因进行同源重组，得到pTPM‑XY质粒，即所述基于mariner转座子构建的自杀型质粒。

【技术特征摘要】
1.一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以pCat-marinerr质粒为模板，以序列at-F和CatR为引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；其中，at-F和CatR的核苷酸序列如下所示：at-F:5’-ccagaactcatgttgcatggtat-3’；CatR:5’-ccaagttctgaGCCTTTTTGCG-3’；(2)以pUC57-tpm质粒为模板，以序列TPM-F和TPM-R为引物，进行PCR扩增，得到tpm抗性基因；其中，TPM-F和TPM-R的核苷酸序列如下所示：TPM-F:5’-tcagaacttggcagtgagtatcca-3’；TPM-R:5’-atgcaacatgagttctggcat-3’；(3)将步骤(1)中得到的扩增产物和步骤(2)中得到的tpm抗性基因进行同源重组，得到pTPM-XY质粒，即所述基于mariner转座子构建的自杀型质粒。2.一种自杀型质粒，其特征在于：通过权利要求1所述的方法构建得到。3.权利要求2所述的自杀型荧光质粒在构建荧光菌株中的应用。4.一种基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：(A)将权利要求2所述的自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，得到大肠杆菌WM3064/pTPM-XY；(B)将大肠杆菌WM3064/pTPM-XY和目标菌株分别培养至对数生长期；(C)将对数生长期的大肠杆菌WM3064/TPM-XY和目标菌株按体积比1：1～10混合均匀后加入到培养基中进行培养，得到含有细菌的培养液；(D)将含有细菌的培养液涂布到含有亚碲酸盐的平板上继续培养，然后挑取单菌落同时接种到单药板和双药板上，再挑选双药板上不生长而单...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙坚，李龚，何玉张，刁晓苑，于泳鑫，刘雅红，廖晓萍，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44