一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用，首先是获得覆盖所选冠状病毒全长基因组的cDNA小片段，然后进行分段克隆，再使用RED/ET重组技术将含有冠状病毒全长基因组的cDNA小片段组装到质粒载体上，筛选获得含有该冠状病毒全长cDNA的感染性克隆。其有益效果在于，本发明专利技术首次利用中低拷贝的质粒载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆，为冠状病毒的感染性克隆的构建开辟了新途径，该方法解决了冠状病毒载体选择困难和病毒大基因组在细菌中不稳定的问题，阳性克隆率高，且获得的反向遗传疫苗株克隆具有完整性、传代稳定性和感染性，拯救效率高，为研究冠状病毒的致病机理和开发新型疫苗等提供了有效工具。

A Method of Constructing Infectious Clone of Coronavirus and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用
本专利技术属于动物基因工程
，更具体地，涉及一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用。
技术介绍
反向遗传学技术是通过构建病毒感染性分子克隆，在DNA水平上进行分子操作，从而研究病毒的结构与功能的方法，由于冠状病毒基因组较大，很难有合适的载体能够容纳如此庞大的基因组来获得病毒。因此冠状病毒基因组的研究一直局限于温度敏感突变株、缺陷病毒以及利用靶向RNA同源重组技术构建的重组病毒，其中靶向RNA同源重组技术是最早用于冠状病毒反向遗传学研究的技术，后来出现了基于痘苗病毒载体和细菌人工染色体(BAC)的冠状病毒反向遗传操作技术，BAC载体具有容量大(理论300kB)，拷贝低(1～2拷贝/E.coli)的特点。目前已报道基于BAC载体构建成功的冠状病毒感染性克隆包括TGEV、SARS-CoV、HCoV-OC43、MERS-CoV和FIPV。然而BAC载体的缺点也是显而易见的，由于拷贝数太低，需要培养大量菌液。BAC提取工作量较大。对于中低拷贝的质粒载体的冠状病毒感染性克隆，目前还没有构建成功的报道。除了质粒载体容量的原因，最主要原因在于冠状病毒基因组较大并且含有对于E.coli具有毒性的序列，其基因组cDNA克隆在大肠杆菌中不稳定，经常造成一些片段的突变或丢失，并且随着质粒拷贝数的增加，这种不稳定性更加明显。因此限制了中低拷贝的质粒在冠状病毒感染性克隆上的应用。鸡传染性支气管炎是一种因传染性支气管炎病毒造成的高度接触性、急性及病毒性的呼吸道疾病。临床上的主要症状是打喷嚏、咳嗽及啰音、肾炎、产蛋率及蛋品质下降等症状。且感染不同日龄或者不同种类的家禽引发的影响不同，主要导致呼吸系统、肾脏、生殖系统等方面的疾病的发生，引发的死亡率较高，从而造成很大的经济损失。传染性支气管炎病毒(IBV)是较为典型的冠状病毒，具有囊膜，是目前已知的RNA病毒中基因组最大的单股正链RNA病毒。该病毒结构蛋白包括核衣壳蛋白，纤突蛋白、小膜蛋白和膜蛋白。由于IBV的RNA聚合酶缺乏校正功能，且纤突蛋白的多变性，并且其基因组复制方式极易发生重组，导致IBV极易发生变异，从而产生新的毒株、基因型或血清型。目前世界范围内报道的IBV毒株至少可以分为30种基因型或血清型。其中Mass型主要包括M14、H52和H120。鸡传染性支气管炎的防制主要为疫苗接种，传统疫苗在安全性、有效性以及成本等方面都存在一定的缺陷，已经研究的基因工程疫苗中亚单位疫苗免疫效果不如传统疫苗，利用基因工程技术的活载体疫苗在表达外源抗原上具有灵活的可操作性，而且能够有效地传递抗原，但目前作为疫苗活载体只有小RNA病毒，例如，新城疫病毒载体和猪繁殖与呼吸综合征病毒载体。
技术实现思路
本专利技术针对于以上问题，提供一种利用中低拷贝的质粒载体构建冠状病毒感染性克隆的方法，克服了现有技术中冠状病毒cDNA在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统方法酶切连接效率低，拯救率低的问题，克服了传统方法不能获得完整全基因组的问题，所述方法包括以下步骤：S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法包括酶切或PCR扩增；S3：PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段，再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装，筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒，其中所述质粒载体包含抗性筛选基因；S4：随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变，得标记片段；S5：酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒，获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合，将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组，筛选得到阳性克隆，其中，所述目标质粒载体为严紧型质粒，容量为1～60Kb，所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组；S6：将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的细胞系，能成功拯救获得该冠状病毒的反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。本专利技术所述构建冠状病毒感染性克隆方法，首先是获得覆盖所选冠状病毒全长基因组的cDNA小片段进行分段克隆，避免了病毒大序列在细菌中毒性和不稳定的问题，同时也克服了常规质粒载体容量小难以承载冠状病毒大序列的问题，其次，使用RED/ET重组技术将含有冠状病毒全长基因组的cDNA小片段一次组装到中低拷贝的质粒载体上，经过筛选，能获得该冠状病毒的反向遗传株的即为含有全长cDNA的感染性克隆。其中，步骤S3中丁型肝炎核酶的作用是：辅助切割以产生精确的病毒基因组3’末端。标记片段的意义在于区分原病毒株和克隆毒株，无义突变是确保突变后所表达的蛋白或呈现的功能不受影响，从而保障克隆毒株的完整性和感染性。上述方法中所涉及的同源重组的操作视为公知，常见的方法为在目标载体上添加与目的基因相同序列的同源臂，在细胞内重组酶的作用下，发生同源重组。本专利技术中的同源重组特指重组酶RecE/T介导的。进一步，步骤S5中所述目标质粒载体为线性载体p15A-cm，所述同源重组所使用的感受态工程菌为GBdirE.coli。进一步，所述步骤S5中阳性克隆的筛选温度为20～30℃。进一步，所述步骤S6还包括辅助质粒的构建，所述辅助质粒包含表达核衣壳蛋白的基因。cDNA在细胞内转染的过程，需要表达核衣壳蛋白来稳定及保护病毒基因组以获得完整的病毒毒株。本专利技术同时提供一种所述构建冠状病毒感染性克隆方法在制备鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆中的应用。进一步，所述冠状病毒为传染性支气管炎病毒的疫苗株。本专利技术也提供一种鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：SS1：提取鸡传染性支气管炎病毒疫苗株的RNA，转录获得cDNA；SS2：以步骤SS1所述cDNA为模板，扩增包含T7启动子和鸡传染性支气管炎病毒疫苗株全基因的A、B、C、D四个片段，以基因合成的pUC47-HDVR-T7ter为模板，扩增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7终止子(T7terminator)的片段E；SS3：将线性质粒pBR322为模板，与步骤SS2中A、B、C、D四个片段分别同源重组，得到分别包含A、B、C、D片段的重组质粒；SS4：选取步骤SS3所得包含D的重组质粒，将其中部分碱基做无义突变，记为突变片段载体pDt；SS5：以质粒p15A-cm-ccdB为模板，扩增得到用于感染性克隆组装的线性载体p15A-cm，酶切步骤SS3和SS4中重组质粒，获取A、B、C和Dt片段，将片段A、B、C、Dt、E和线性载体p15A-cm共转入感受态细胞GBdirE.coli中，抗性筛选获得阳性克隆；SS6：以步骤SS1所得cDNA为模板，扩增得到的N基因再与质粒pVAX1同源重组，构建得到表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N；SS7：将步骤SS6所述表达N基因的质粒载体pVAX1-N与步骤SS5所得感染性克隆共转染BSR-T7/5细胞，能拯救获得鸡传染性支气管炎病毒反向遗传株的感染性克隆即为含有该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法为PCR扩增；S3：PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段，再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装，筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒，其中所述质粒载体包含抗性筛选基因；S4：随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变，得标记片段；S5：酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒，获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合，将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组，筛选得到阳性克隆，其中，所述目标质粒载体为严紧型质粒，容量为1～60Kb，所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组；S6：将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的细胞系，能成功拯救获得该冠状病毒反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。...

【技术特征摘要】
1.一种构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法为PCR扩增；S3：PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段，再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装，筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒，其中所述质粒载体包含抗性筛选基因；S4：随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变，得标记片段；S5：酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒，获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合，将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组，筛选得到阳性克隆，其中，所述目标质粒载体为严紧型质粒，容量为1～60Kb，所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组；S6：将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的细胞系，能成功拯救获得该冠状病毒反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。2.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，步骤S5中所述目标质粒载体为线性载体p15A-cm，所述同源重组所使用的感受态工程菌为GBdirE.coli。3.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述步骤S5中阳性克隆的筛选温度为20～30℃。4.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述步骤S6中辅助质粒包含表达核衣壳蛋白的基因。5.一种权利要求1～4任意一项所述构建冠状病毒感染性克隆方法在制备鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆中的应用。6.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，封柯宇，邵冠明，张新珩，邵洋洋，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44