本发明专利技术属于基因工程领域，更具体地说本发明专利技术涉及一种含有WPRE‑polyA元件的核苷酸序列tWPRE及其基因表达载体和应用。所述含有WPRE‑polyA元件的核苷酸序列tWPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述基因表达载体包括上述的核苷酸序列tWPRE。本发明专利技术进一步改进了WPRE‑polyA元件，得到了优化元件tWPRE，同时在质粒转染和病毒感染两方面验证了tWPRE元件的有效性，在扩大载体容量的同时保证了高效的转基因表达效率和病毒感染效率，有助于AAV载体携带更多的特异性启动子和基因，扩大了AAV病毒的作用范围，为基础科研和临床研究提供了一种新的更特异且更高效的表达工具。
【技术实现步骤摘要】
核苷酸序列tWPRE及其基因表达载体和应用
本专利技术属于基因工程领域，更具体地说本专利技术涉及一种核苷酸序列tWPRE及其基因表达载体和应用。
技术介绍
腺相关病毒载体系统(AAV)具有低免疫原性，能感染分裂和非分裂细胞，以及在宿主细胞中维持长程表达，与慢病毒载体系统相比，在实现基因治疗人类疾病中表现出绝对的优势。目前，腺相关病毒载体系统(AAV)在国外已被用于多种基因疗法并进入临床试验，且取得良好效果，如失明、心脏病、肌营养不良、听觉丧失，肺癌、帕金森患者脑部等疾病。同时目前还没有发现任何一例以腺相关病毒载体为基因导入系统的临床试验出现副作用或严重死亡事件等，证明了腺相关病毒载体系统(AAV)的安全可靠性。除了临床应用，AAV载体也在基础研究领域中得到了广泛的应用。虽然AAV载体具有很多其它病毒载体无法比拟的优势,但是AAV载体包装的常规承载量只有4.2-4.7kbp，不足以携带较大片段的组织特异性启动子或者特定的大片段基因表达，这在一定程度上局限了AAV载体的使用范围。因此，改进AAV载体元件，增加载体容量，有助于AAV病毒载体携带更多的外源核酸物质，为基础科研和临床研究提供更特异，更高效的表达工具。WPRE(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement)即土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，长度大约600bp，属于顺式作用元件(DNA序列)，由gamma，alpha，beta等三部分构成。WPRE的主要功能如下：1)参与AAV病毒的包装；2)帮助检测AAV病毒的滴度；3)同时有效帮助mRNA的polyA加尾效率，增强转基因的表达和稳定。poly(A)可以终止转录，将poly(A)补加到转录体的3’端，增强RNA的稳定性，提高翻译效率；部分长度的poly(A)对目的基因终止可能没有太大影响，但对蛋白表达可能会有一定影响。因此，WPRE和poly(A)这两个元件对AAV病毒的包装和基因表达具有重要的作用。有研究报道，保留gamma和alpha部分的WPRE元件可以与SV40poly(A)融合成为只有399bp长度的片段，可以维持AAV病毒的包装和转基因的表达，然而忽略了病毒滴度的检测。因此，如何在不影响病毒包装、滴度检测和表达的前提下，尽可能增大载体容量，扩大AAV病毒的作用范围，仍然有待于进一步研究和改进。
技术实现思路
本专利技术公开了一种含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，包括所述tWPRE序列的基因表达载体可在不影响病毒包装、滴度检测和表达的前提下，尽可能的增大载体容量，扩大了AAV病毒的作用范围，为基础科研和临床研究提供了一种新的更特异且更高效的表达工具。本专利技术的具体方案如下：本专利技术一方面公开了一种含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，所述tWPRE的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列(及本专利技术中的其他序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列也在本专利技术的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本专利技术的保护范围之内。本专利技术第二个方面公开了一种基因表达载体，包括上述的核苷酸序列tWPRE。优选的，所述载体包括骨架质粒。更优选的，所述骨架质粒为pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLA-WPRE-hGHpolyA。应当理解，专利技术并不限于骨架质粒pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLA-WPRE-hGHpolyA，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适载体来完成本专利技术，并且在本专利技术的保护范围之内。优选的，所述基因表达载体为pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLAG-tWPRE，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术第三个方面公开了一种构建上述的基因表达载体的方法，包括以下步骤：S1：合成核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列tWPRE；S2：将骨架质粒双酶切后回收纯化；S3：将S2中回收纯化的产物与S1中的核苷酸序列tWPRE连接；S4：将连接后的质粒进行转化涂板；S5：挑取单菌落并进行测序鉴定。将测序正确的阳性克隆子进行保存备用。在本专利技术的一优选实施例中，在S2中，将pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLA-WPRE-hGHpolyA用Agel和BstEII进行双酶切。50μL酶切反应体系含pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S1110ug、10×Cutsmart(NEB)5μL、AgeI和BstEII各2μL，用水补足至50μL，37℃酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化。应当理解，专利技术并不限于限制性内切酶Agel和BstEII，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适限制性内切酶来完成本专利技术，并且在本专利技术的保护范围之内。在本专利技术的一优选实施例中，在S3中，将S2中回收纯化的产物与S1中的核苷酸序列tWPRE进行无缝克隆。50μL反应体系分别含S2中酶切产物102.2ng，S1合成序列14.3ng，1ul酶，25ulbuffer，用水补足至50μL，50℃反应15min后置于冰上进行转化涂板。本专利技术第四个方面公开了上述的核苷酸序列tWPRE或者上述的基因表达载体在细胞转染中的应用。本专利技术第五个方面公开了上述的基因表达载体进行细胞转染的方法，包括以下步骤：(1)接种细胞；(2)待细胞汇合度至50％-80％时，将权利要求2-5中任意一项所述的基因表达载体转染细胞。在本专利技术的一个实施例中，所述细胞为哺乳动物细胞，具体的，所述细胞为293T细胞(购买于美国ATCC细胞库)。应当理解，在本专利技术的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的细胞种类，并且本专利技术的保护范围之内。优选的，待细胞汇合度为70％-80％时进行转染。在本专利技术的一具体实施例中，待细胞融合度达到70％～80％时，弃去细胞上清液，加入Opti-MEM培养基，1小时后将pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLAG-tWPRE质粒0.5μg经Lipo2000试剂，转染到293T细胞中，转染48小时后拍荧光照片。本专利技术第六个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的核苷酸序列tWPRE或上述的基因表达载体。本专利技术第七个方面公开了上述的核苷酸序列tWPRE、上述的基因表达载体或者上述的试剂盒在扩大AVV病毒载体容量中的应用。本专利技术第八个方面公开了一种AVV病毒，其包括上述的核苷酸序列tWPRE或上述的基因表达载体。在本专利技术的一个实施例里面，将骨架质粒和pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLAG-tWPRE包装成AAV病毒。本专利技术第九个方面公开了如下a)或b)的应用：a)上述的核苷酸序列tWPRE或上述的基因表达载体在制备上述的试剂盒中的应用；b)上述的核苷酸序列tWPRE或上述的基因表达载体在制备上述的AVV病毒中的应用。本专利技术第十个方面公开了上述的AVV病毒在细胞感染中的应用。在符合本领域常识的基础上，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含有WPRE‑polyA元件的核苷酸序列tWPRE，其特征在于，所述tWPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，其特征在于，所述tWPRE的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种基因表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的核苷酸序列tWPRE。3.根据权利要求2所述的基因表达载体，其特征在于，所述载体包括骨架质粒。4.根据权利要求3所述的基因表达载体，其特征在于，所述骨架质粒为pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLA-WPRE-hGHpolyA。5.根据权利要求2所述的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体为pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLAG-tWPRE，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。6.一种构建权利要求2-5中任意一项所述的基因表达载体的方法，其特性在于，包括以下步骤：S1：合成核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列tWPRE；S2：将骨架质粒双酶切后回收纯化；S3：将S2中回收纯化的产物与S1中的核苷酸序列tWPRE连接；S4：将连接后的质粒进行转化涂板；S5：挑取单菌落并进行测序鉴定。7.根据权利要求1所述的核苷酸序列tWPRE或者权利要求2-5中任意一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨蕊菊，杨兴林，刘晓芬，夏清梅，杨佳丽，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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