一种肠道病毒71型的抑制剂及应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体公开了一种肠道病毒71型的抑制剂及应用，所述的抑制剂为多肽P2，P2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；本发明专利技术还公开了多肽P2的改造体，所述的改造体为3A‑TAT‑EP、3A‑EP‑DRI或3A‑EP‑PEG4‑PA，3A‑TAT‑EP的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示、3A‑EP‑DRI的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示、3A‑EP‑PEG4‑PA的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。P2系列多肽有高效的抗病毒活性。这将为人类肠道病毒71型的防控提供了一种新的策略，同时也为加快抗人肠道病毒71型的多肽小分子药物的研发提供了新的理论依据。

An Inhibitor of Enterovirus 71 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种肠道病毒71型的抑制剂及应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种肠道病毒71型的抑制剂及应用。
技术介绍
人肠道病毒71型(EV71)是引发手足口病的主要病原体之一，EV71感染能够导致严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等,具有较高的病死率和致残率。目前针对EV71的药物还处于实验研究阶段，这些药物一般是一或多个多肽或小分子化合物。该类多肽或化合物可以干扰或阻断EV71进入宿主细胞的某一步骤，例如膜融合步骤。或者抑制逆EV71的复制酶，蛋白酶，膜定位酶，从而达到抗EV71的效果。本专利技术涉及的高分子及其衍生物能够抑制病毒逃逸天然免疫的能力，是一种新兴的EV71治疗药物，其针对新的靶点，对抗耐药等具有重要意义。RNA干扰是一种抗病毒免疫机制。在RNA干扰抗病毒过程中，病毒RNA复制产生的双链RNA被宿主Dicer蛋白识别并切割成小干扰RNA。这些病毒衍生的小干扰RNA被转移并组装成RNA诱导沉默复合体，介导同源病毒RNA的降解，从而达到抗病毒的目的。EV71的非结构蛋白3A能够与病毒双链RNA结合来阻止Dicer对其剪切，抑制病毒来源小干扰RNA的产生，从而达到逃逸RNA干扰抗病毒免疫的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种肠道病毒71型的抑制剂，所述的抑制剂为多肽P2、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI或3A-EP-PEG4-PA，所述的P2的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示、3A-TAT-EP的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示、3A-EP-DRI的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示、3A-EP-PEG4-PA的氨基酸序列为SEQIDNO.5所示。本专利技术的另一个目的在于提供了一种肠道病毒71型的抑制剂的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：本专利技术的专利技术思路如下：EV713A蛋白含有86个氨基酸残基。3A具有二聚化的能力，其二聚化对3A正确行使功能起到关键作用。申请人依据3A二聚化结构域两个螺旋结构组成和序列特点，设计了一段EP多肽序列(SEQIDNO.1所示)，该序列可以与EV71非结构蛋白3A结合，干扰3A蛋白二聚体的形成过程，从而抑制病毒的复制及感染。根据上述思路，申请人为了能让该抑制剂能穿透细胞膜进入到细胞从而起到抑制病毒的作用，申请人以EP多肽为核心序列，设计了多肽P2(SEQIDNO.2所示)，其能够与α1竞争性相互作用，从而阻止3A二聚化，起到抑制3A抗天然免疫能力的作用，最终达到抗病毒的目的。申请人还在P2的基础上，对其结构进行改造，构建了一系列的改造体，经试验证实，经改造后的P2，实验证实，提高了抑制病毒的能力，对人肠道病毒的防控和治疗方面具有重大的意义。所述的改造体为：3A-TAT-EP、3A-EP-DRI和3A-EP-PEG4-PA；所述的3A-TAT-EP的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示、3A-EP-DRI的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示、3A-EP-PEG4-PA的氨基酸序列为SEQIDNO.5所示，其中3A-EP-PEG4-PA中不添加穿膜序列，在C端对多肽进行了棕榈酸化的修饰，并用PEG4分子作为连接子进行链接，棕榈酸化可使不含有穿膜肽的多肽具有穿过细胞膜的活性；。一种肠道病毒71型的抑制剂的应用，包括利用本专利技术提供的P2以及P2改造体制备成肠道病毒71型的抑制剂，或是利用本专利技术提供的P2以及P2改造体与其他有效成分一起，制备成肠道病毒71型的抑制剂，或是利用本专利技术提供的P2以及P2改造体制备治疗或预防肠道病毒71型病毒感染的药物。本专利技术的保护内容还包括，依据P2多肽，对其替换不同的穿膜序列、或进行多肽修饰、或进行非天然氨基酸的设计和改造后具有抑制EV71的活性的抑制剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：P2系列多肽有高效的抗病毒活性。这将为人类肠道病毒71型的防控提供了一种新的策略，同时也为加快抗人肠道病毒71型的多肽小分子药物的研发提供了新的理论依据。并且P2系列多肽清晰的抗病毒机制，可以保证其应用的安全性和优化途径的明确性，便于以后的进一步开发。附图说明图1为通过荧光标记检测多肽P2能够穿过细胞膜进入胞浆的示意图。图2为通过CCK-8测定多肽P2的细胞毒性示意图；结果表明在多肽P2浓度≤100μM的时候对细胞没有毒性。图3为P2在RD细胞中的药效示意图。图4为多肽P2在多种细胞中均对病毒有抑制作用的示意图。图5为对多肽P2进行改造后的多肽的抗病毒效果示意图。图6为多肽3A-EP-DRI和3A-TAT-EP的抗病毒效果示意图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，菌来源于商业渠道。本专利技术通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本专利技术的范围或实施方式的限制。在不偏离本专利技术的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本专利技术的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本专利技术的范围内。本专利技术涉及到的多肽如下：实施例1：多肽P2穿膜效率检测(MakramEssafi,AliceD.Baudot,XavierMouska,Jill-PatriceCassuto,MichelTicchioniandMarcelDeckert.VirusanddsRNA-triggeredtranscriptionalresponsesrevealkeycomponentsofhoneybeeantiviraldefense.SciRep[J],7:6448,2017)1.材料：MEM培养基(thermo)，血清(gibco)购自英潍捷基公司，免疫荧光平皿(NEST)购自启动子公司，PBS，DAPI，多聚甲醛购自迪跃创新公司。多肽P2由南京金斯瑞公司合成，其序列为SEQIDNO.2所示。2.实验过程实验分为两组，为了避免加入EV71病毒对多肽进入细胞产生的影响，一组实验加入EV71病毒后加多肽P2，另一组不加病毒只加多肽，且每组做好阴性对照。免疫荧光步骤如下：(1)在免疫荧光专用皿中铺1mlRD细胞，待其长到30％融合度时收样。(2)吸出培养基，用1ml0.01mol/L，pH7.4的PBS洗去残余培养基，洗三次，每次5min。(3)配制4％多聚甲醛溶液，将4g多聚甲醛溶解于100mlPBS。将配好的4％多聚甲醛加1ml到每个皿中，反应5min，目的是将细胞固定。(4)吸出4％多聚甲醛，再加入1ml0.01mol/L，pH7.4的PBS洗去残余的多聚甲醛，洗三次，每次5min。(5)将1mg/ml的DAPI溶液用PBS稀释到100ng/ml，加入皿中，反应15min。(6)吸出反应液，再次加入1ml0.01mol/L，pH7.4的PBS洗去残余反应液，洗三次，每次5min。(7)将平皿放置于荧光显微镜下观察。如图1，在未加病毒及加病毒的细胞中，均能观察到多肽入胞，证明多肽P2有很好的穿膜能力。实施例2：多肽P2的细胞毒性测定(JieliangChen12WenZhang12JunyuLin1FanWang12MinWu2CuncunChen13YeZheng2XiuhuaPeng2JianhuaLi1ZhenghongYu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肠道病毒71型的抑制剂，所述的抑制剂为多肽P2，所述的P2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种肠道病毒71型的抑制剂，所述的抑制剂为多肽P2，所述的P2的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述抑制剂制备的改造体，所述的改造体为3A-TAT-EP、3A-EP-DRI或3A-EP-PEG4-PA，所述的3A-TAT-EP的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示、3A-EP...

【专利技术属性】
技术研发人员：周溪，陆路，方媛，秦成峰，姜世勃，邱洋，刘泽众，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，复旦大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42