一种免仪器酶联免疫吸附测定方法技术

本发明专利技术公开了一种免仪器酶联免疫吸附测定方法。该方法通过在96孔板中进行抗原‑抗体特异性免疫反应，捕获样本中的分析物抗原或抗体，随后引入纳米颗粒催化氯金酸‑还原剂之间生成纳米金的反应，并使用手表或手机记录混合溶液呈现红色所需的时间，该时间与样品中目标抗原或抗体的浓度呈负相关，即完成免仪器酶联免疫吸附测定。本发明专利技术使用随处可见的手表或手机进行信号读取，降低了定量分析的成本。它还协同使用脂质体包裹大量纳米颗粒以及它们对氯金酸被还原剂还原生成纳米金反应的高效催化活性，放大单个抗原‑抗体特异性结合反应的响应信号，提高了检测灵敏度。

An instrument-free enzyme-linked immunosorbent assay

【技术实现步骤摘要】
一种免仪器酶联免疫吸附测定方法
本专利技术属于酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmune-SorbentAssay，简写为ELISA）
，具体涉及一种免仪器酶联免疫吸附测定方法。
技术介绍
酶联免疫吸附测定（ELISA）方法是以免疫学反应为基础，将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高灵敏度的实验技术。根据样品中待测目标物的种类及性质不同，可以设计出各种不同类型的ELISA方法，包括抗体夹心法、抗原夹心法、竞争法、间接法及捕获包被法等。自1971瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann首次建立酶联免疫吸附测定方法，经过40余年的不断发展和完善，ELISA方法已经被广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、环境监测等诸多领域。目前传统的ELISA方法主要借助酶标仪、荧光仪等光学分析仪器实现目标物的定量检测。但是，这些光学仪器价格较为昂贵且体积庞大，导致传统ELISA方法的分析成本较高，同时不能用于现场分析和即时检测（Point-of-CareTesting，POCT）。此外，在一些重要的应用方面，例如，疾病的早期诊断，还需要进一步提高ELISA方法的检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种免仪器酶联免疫吸附测定方法。本专利技术的思路：一方面，使用常见的价格低廉的手表或手机代替酶标仪、荧光仪等传统的光学分析仪器进行信号读取，降低定量分析的成本。另一方面，使用脂质体包裹大量的纳米颗粒，进而结合这些纳米颗粒对氯金酸被还原剂还原生成纳米金反应的高效催化活性，放大在96孔板上进行的单个抗原-抗体结合反应的响应信号，从而显著提高检测灵敏度。具体步骤为：步骤一，在96孔板中固定抗体或抗原。步骤二，封闭96孔板的剩余活性位点。步骤三，依次加入样品溶液、生物素标记的抗体或二抗、链霉亲和素标记的包裹了具有催化活性的纳米颗粒的脂质体探针。步骤四，超声作用下裂解脂质体以释放催化活性纳米颗粒，随后加入氯金酸和还原剂的混合水溶液，在催化活性纳米颗粒的催化作用下，氯金酸被还原剂快速还原生成纳米金，通过目视观测溶液颜色变化，同时使用手表或手机记录自加入氯金酸和还原剂的混合水溶液到混合溶液完全呈现红色所需的时间，该时间与样品中目标抗原或抗体的浓度呈负相关。所述步骤一中的抗体或抗原在96孔板中的固定方式为物理吸附和共价结合中的一种。所述步骤二中的96孔板的剩余活性位点的封闭过程通过加入封闭试剂溶液来实现，封闭试剂在96孔板中的固定方式与抗体或抗原在96孔板中的固定方式一样，其作用是完全封闭96孔板的剩余活性位点，避免后续加入到样品中的抗原或抗体、生物素标记的抗体或二抗、链霉亲和素标记的包裹了具有催化活性的纳米颗粒的脂质体探针在96孔板表面产生非特异性吸附影响。所述步骤三中的三种溶液是依次加入，通过抗原-抗体特异性免疫反应，样品中的抗体或抗原在被96孔板上的抗原或抗体特异性捕获后，进一步结合生物素标记的抗体或二抗，随后在生物素-亲和素反应下，将链霉亲和素标记的包裹了催化活性的纳米颗粒的脂质体探针捕获到96孔板表面。所述步骤四中的超声作用裂解脂质体探针，所有被捕获到96孔板表面的脂质体都完全裂解，所有被包裹的纳米颗粒完全被释放到溶液中。所述具有催化活性的纳米颗粒是金属纳米颗粒、无机纳米颗粒和有机纳米颗粒中的一种，能够高效催化氯金酸-还原剂之间的氧化还原反应，快速还原生成外观颜色为红色的纳米金溶液。与现有的ELISA方法相比，本专利技术的突出优点在于：1）使用价格低廉的手表或手机进行信号读取，在降低分析成本的同时，还可实现样品现场分析和POCT检测；2）在保持传统ELISA方法良好特异性的同时，协同使用脂质体包裹大量纳米颗粒以及它们对氯金酸被还原剂还原生成纳米金反应的高效催化活性，放大单个抗原-抗体特异性结合反应的响应信号，显著提高检测灵敏度；3）与现有ELISA方法完全兼容，可直接推广应用于尿液、血液、血清、唾液、水等各种溶液样品中目标物的定量检测，在临床诊断、医学研究、食品安全、环境监测等领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术的免仪器酶联免疫吸附测定方法的原理示意图。采用的是双抗体夹心法检测目标物抗原。图中标记：1—96孔板上的一个孔；2—抗体；3—无色溶液；4—封闭剂（牛血清白蛋白）；5—目标物抗原；6-1—生物素标记抗体上的抗体；6-2—生物素标记抗体上的生物素；7-1—脂质体；7-2—包裹在脂质体内的纳米颗粒（纳米铜颗粒）；7-3—标记在脂质体表面的链霉亲和素；8—超声作用；9—氯金酸；10—还原剂（抗坏血酸）；11—手机；12—纳米金；13—红色溶液。图2为本专利技术实施例1中使用本专利技术的免仪器酶联免疫吸附测定方法检测1pg/mL人癌基因蛋白质（HumanOncogeneProtein，HOP）p190/bcr-abl抗原时所记录的时间值（Time）与空白样品（blank）所得时间值的比较。图3为本专利技术实施例2中使用本专利技术的免仪器酶联免疫吸附测定方法检测一系列不同浓度的HOP抗原时所记录的时间值（Time）与HOP浓度的Log值（LogCHOP）之间的工作曲线。具体实施方式下面以基于双抗体夹心法免疫反应模式检测HOP抗原（模型目标物）的ELISA方法为例，在该方法中利用手机进行信号读取，并通过协同使用脂质体包裹大量纳米颗粒以及它们对氯金酸被还原剂还原生成纳米金反应的高效催化活性来提高检测灵敏度。以下实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1:使用本专利技术的免仪器酶联免疫吸附测定方法检测1pg/mLHOP抗原和空白样品（blank，不含分析物的缓冲溶液）。如图1所示，本实施例的具体步骤为：步骤一，往96孔板上的一个孔中加入100μL0.2mg/mLHOP抗体（12mM碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH9.5），冰箱4℃下静置过夜。弃去液体，甩干。将每个孔加满洗涤液（10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，pH7.2），静置40s后弃去，如此重复5次后将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干。步骤二，往单个孔加入100μL15mg/mL牛血清白蛋白（BSA）（12mM碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH9.5），室温下静置5h。弃去液体，甩干。随后加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次后将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干。步骤三，往单个酶标孔依次加入100μL1pg/mLHOP抗原样品溶液（10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH7.2）、100μL0.1mg/mL生物素标记的HOP抗体（10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH7.2）以及100μL0.1mg/mL链霉亲和素标记的包裹了纳米铜颗粒（粒径约为10nm）的脂质体（粒径约为300nm）探针悬浊液（10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH7.2），轻微震荡混匀后置于37℃反应1h，弃去液体，甩干，将每个孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次后将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干。步骤四，往孔加入100μL10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液（pH7.2），超声器中超声处理20s后继续加入100μL500μM氯金酸和1mM抗坏血酸混合水溶液。步骤五，当加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免仪器酶联免疫吸附测定方法，其特征在于具体步骤为：步骤一，在96孔板中固定抗体或抗原；步骤二，封闭96孔板的剩余活性位点；步骤三，依次加入样品溶液、生物素标记的抗体或二抗、链霉亲和素标记的包裹了具有催化活性的纳米颗粒的脂质体探针；步骤四，超声作用下裂解脂质体以释放催化活性纳米颗粒，随后加入氯金酸和还原剂的混合水溶液，在催化活性纳米颗粒的催化作用下，氯金酸被还原剂快速还原生成纳米金，通过目视观测溶液颜色变化，同时使用手表或手机记录自加入氯金酸和还原剂的混合水溶液到混合溶液完全呈现红色所需的时间，该时间与样品中目标抗原或抗体的浓度呈负相关；所述步骤一中的抗体或抗原在96孔板中的固定方式为物理吸附和共价结合中的一种；所述步骤二中的96孔板的剩余活性位点的封闭过程通过加入封闭试剂溶液来实现，封闭试剂在96孔板中的固定方式与抗体或抗原在96孔板中的固定方式一样，其作用是完全封闭96孔板的剩余活性位点，避免后续加入到样品中的抗原或抗体、生物素标记的抗体或二抗、链霉亲和素标记的包裹了具有催化活性的纳米颗粒的脂质体探针在96孔板表面产生非特异性吸附影响；所述步骤三中的三种溶液是依次加入，通过抗原‑抗体特异性免疫反应，样品中的抗体或抗原在被96孔板上的抗原或抗体特异性捕获后，进一步结合生物素标记的抗体或二抗，随后在生物素‑亲和素反应下，将链霉亲和素标记的包裹了催化活性的纳米颗粒的脂质体探针捕获到96孔板表面；所述步骤四中的超声作用裂解脂质体探针，所有被捕获到96孔板表面的脂质体都完全裂解，所有被包裹的纳米颗粒完全被释放到溶液中；所述具有催化活性的纳米颗粒是金属纳米颗粒、无机纳米颗粒和有机纳米颗粒中的一种，能够高效催化氯金酸‑还原剂之间的氧化还原反应，快速还原生成外观颜色为红色的纳米金溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种免仪器酶联免疫吸附测定方法，其特征在于具体步骤为：步骤一，在96孔板中固定抗体或抗原；步骤二，封闭96孔板的剩余活性位点；步骤三，依次加入样品溶液、生物素标记的抗体或二抗、链霉亲和素标记的包裹了具有催化活性的纳米颗粒的脂质体探针；步骤四，超声作用下裂解脂质体以释放催化活性纳米颗粒，随后加入氯金酸和还原剂的混合水溶液，在催化活性纳米颗粒的催化作用下，氯金酸被还原剂快速还原生成纳米金，通过目视观测溶液颜色变化，同时使用手表或手机记录自加入氯金酸和还原剂的混合水溶液到混合溶液完全呈现红色所需的时间，该时间与样品中目标抗原或抗体的浓度呈负相关；所述步骤一中的抗体或抗原在96孔板中的固定方式为物理吸附和共价结合中的一种；所述步骤二中的96孔板的剩余活性位点的封闭过程通过加入封闭试剂溶液来实现，封闭试剂在96孔板中的固定方式与抗体或抗原在96孔板...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，刘召应，聂瑾芳，黄锦坤，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西,45