一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法技术

本发明专利技术涉及检测人血浆中药物浓度的方法，以甲醇蛋白沉淀法对样品进行前处理，并进行进一步稀释，应用超高效液相色谱串联质谱进行检测。本发明专利技术提供的方法可以同时检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种物质，且对色谱柱和仪器损害小。

A METHOD FOR DETERMINATION OF SACUBATRIC, DEETHYL SACUBATRIC AND VALSARTAN CONCENTRATIONS IN HUMAN PLASMA

【技术实现步骤摘要】
一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法
本专利技术涉及检测人血浆中药物浓度的方法。具体而言，本专利技术涉及一种通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法。
技术介绍
沙库巴曲缬沙坦钠，适用于射血分数降低的慢性心力衰竭(NYHAⅡ-Ⅳ级，LVEF≤40％)成人患者，能降低心血管死亡和心力衰竭住院的风险。另外，沙库巴曲缬沙坦钠可代替血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，可与其他心力衰竭治疗药物合用。沙库巴曲缬沙坦钠是一种首创的双效血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂，具有独特的作用模式，能够增强心脏的保护性神经内分泌系统(钠尿肽系统)，抑制有害系统(肾素-血管紧张素-醛固酮系统)，同时表现出了超越常规药物的更高安全性。口服给药后，沙库巴曲缬沙坦钠以沙库巴曲(脑啡肽酶抑制剂前药)：缬沙坦＝1:1的比例分布于全身，然后沙库巴曲迅速被非特异性酯酶代谢为活性的脑啡肽酶抑制剂—去乙基沙库巴曲。为同时检测人体血浆当中沙库巴曲(AHU377)、去乙基沙库巴曲(LBQ657)和缬沙坦(Valsartan)的量，现有技术开发了一系列检测方法。MizukiAkahori等发表的文章(Pharmacokineticsaftersingleascendingdose,foodeffect,andsafetyofsacubitril/valsartan(LCZ696，),anangiotensinreceptorandneprilysininhibitor,inhealthyJapanesesubjects.[J]EurJDrugMetabPharmacokinet,2016.)，应用液液萃取处理血浆样品，并采用HPLC-MS/MS检测AHU377、LBQ657和Valsartan三种物质。该方法虽然可以检测三种物质，但是前处理方法毒性较大，对技术人员造成较大的伤害且处理过程较为繁琐。且流动相采用0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈，甲酸量较大,长期使用对色谱柱有较大损害。RajaHarandha等发表的文章(DevelopmentandvalidationofareliableandrapidLC-MS/MSmethodforsimultaneousquantificationofsacubitrilandvalsartaninratplasmaanditsapplicationtoapharmacokineticstudy.[J]BiomedicalChromatography,2016.)，采用甲酸-乙腈蛋白沉淀法，并采用UPLC-MS/MS检测大鼠血浆样品中的沙库巴曲和缬沙坦。该方法虽然采用蛋白沉淀法，但是并未对处理后的样品进行稀释，后续一方面会对色谱柱造成较大破坏，也会因为样品中的杂质较多对液相系统和质谱造成堵塞。流动相为0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈且采用梯度洗脱的方式，甲酸的量也会对色谱柱造成较大的破坏，梯度洗脱的方式也不稳定。并且本方法仅检测了AHU377和Valsartan两种物质。目前，现有技术中缺乏一种可以快速检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种物质，并对仪器设备和技术人员友好的方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种新的检测方法，该方法可以同时检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种物质，操作简单，毒性小，样品前处理后进一步稀释对色谱柱和仪器损害小，采用等度洗脱即可实现分析物有效分离，色谱系统也更加稳定。本专利技术的目的是提供一种同时检测人血浆样品中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦浓度的方法：样品前处理：甲醇蛋白沉淀法；样品前处理后稀释进样的稀释剂：70％～90％甲醇水；稀释比例：1:3～1:7；检测仪器：超高效液相色谱串联质谱；色谱柱：WatersAtlantisC18，规格为2.1mm×100mm，3.0μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸水；流动相的体积比：50:50～65:35；洗脱方式：等度洗脱；流速：0.2ml/min～0.6ml/min；柱温：15℃～25℃；进样量：5μL～10μL质谱：使用电喷雾离子源，三重四级杆检测器，正离子多反应监测。本专利技术优选方案，甲醇蛋白沉淀法中，血浆样品与甲醇体积比为1:2～1:4，优选1:2。体积比的范围都满足实验需要，优选的体积比加入有机溶剂量最小，之后进样得到的色谱峰，峰型最合适，响应信号最好。本专利技术优选方案，内标为分析物的氘代衍生物，优选沙库巴曲-d4、缬沙坦-d3和去乙基沙库巴曲-d4。优选方案的内标容易购买，价格实惠。本专利技术优选方案，稀释剂优选80％甲醇水，样品溶液和稀释剂的稀释体积比为1:5。专利技术人发现80％的甲醇水，稀释体积比1:5，得到的色谱峰峰型最好。本专利技术优选方案，流动相乙腈-0.1％甲酸水的体积比是60:40。专利技术人发现甲酸含量增加可以提高响应值，但是很大程度上会减少色谱柱及液相和质谱系统的使用寿命。优选的流动相的比例即响应信号和峰型最好，也在仪器和色谱柱的耐受范围。本专利技术优选方案，流速为0.4ml/min。优选流速，出峰时间在3min以内，既能使分析物彻底分离，也不会因为出峰时间过快或过慢影响分析需要。本专利技术优选方案，柱温为20℃。本专利技术优选方案，进样量为5μL。本专利技术的检测方法与现有技术相比具有以下优势：(1)样品前处理简单，低毒。采用甲醇蛋白沉淀法，之后甲醇水稀释峰型良好，响应信号较高，溶剂使用量小，操作简单，毒性低，更适合大批量检测样品。(2)对色谱柱和仪器损害小。一方面：甲醇蛋白沉淀法并未加入酸，不会对色谱柱造成损伤。样品处理之后进一步经过稀释进样检测，所得峰型响应高、峰型良好，长期且大批量检样，不会堵塞色谱柱和仪器，对仪器损害小。另一方面：专利技术人发现甲酸含量增加可以提高响应值，但是很大程度上会减少色谱柱及液相和质谱系统的使用寿命，尤其对价格昂贵的质谱有较大影响。本专利技术流动相的比例既可以提高响应信号，也在仪器和色谱柱的耐受范围。(3)内标更合适。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同的或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。就本领域技术人员而言，分析物的氘代衍生物与分析物相比，基本的理化性质相同，仅分子量有差别，是最佳的内标物质。(4)对本方法的专属性、标准曲线、精密度和准确度、提取回收率、基质效应与稳定性进行了验证，均符合药典规定。本专利技术所述方法已成功应用于临床药代动力学研究。附图说明图1-1：稀释剂为80％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-AHU377。图1-2：稀释剂为80％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-LBQ657。图1-3：稀释剂为80％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-Valsartan。图2-1：稀释剂为纯水时高效液相质谱MRM色谱图-AHU377。图2-2：稀释剂为纯水时高效液相质谱MRM色谱图-LBQ657。图2-3：稀释剂为纯水时高效液相质谱MRM色谱图-Valsartan。图3-1：稀释剂为50％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-AHU377。图3-2：稀释剂为50％甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦浓度的方法，其特征在于：样品前处理：甲醇蛋白沉淀法；样品前处理后稀释进样的稀释剂：70％～90％甲醇水；稀释进样的体积比：1:3～1:7；检测仪器：超高效液相色谱串联质谱；色谱柱：Waters Atlantis C18，规格为2.1mm×100mm，3.0μm；流动相：乙腈‑0.1％甲酸水；流动相的体积比：50:50～65:35；洗脱方式：等度洗脱；流速：0.2ml/min～0.6ml/min；柱温：15℃～25℃；进样量：5μL～10μL；质谱：使用电喷雾离子源，三重四级杆检测器，正离子多反应监测。

【技术特征摘要】
2019.03.20 CN 20191021118871.一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦浓度的方法，其特征在于：样品前处理：甲醇蛋白沉淀法；样品前处理后稀释进样的稀释剂：70％～90％甲醇水；稀释进样的体积比：1:3～1:7；检测仪器：超高效液相色谱串联质谱；色谱柱：WatersAtlantisC18，规格为2.1mm×100mm，3.0μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸水；流动相的体积比：50:50～65:35；洗脱方式：等度洗脱；流速：0.2ml/min～0.6ml/min；柱温：15℃～25℃；进样量：5μL～10μL；质谱：使用电喷雾离子源，三重四级杆检测器，正离子多反应监测。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述甲醇蛋白沉淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：高娜，于云鹏，王小彦，张瑞兴，祁欢欢，毕宇鑫，
申请(专利权)人：石药集团中奇制药技术石家庄有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13