一种提高番木瓜环斑病毒抗体特异性的方法技术

本发明专利技术公开一种用于从抗血清中纯化番木瓜环斑病毒高特异性抗体的方法，该方法采用的填料表面使用了番木瓜环斑病毒外壳蛋白不同区域的多肽片段作为配基，使填料能够吸附外壳蛋白不同区域的特异性抗体。一种纯化方法使用上述的填料进行抗体的纯化。

A Method to Improve the Specificity of Papaya Ring Spot Virus Antibody

The invention discloses a method for purifying papaya ringspot virus high specific antibody from antiserum. The method uses polypeptide fragments of different regions of papaya ringspot virus coat protein as ligands on the surface of the filler, so that the filler can adsorb specific antibodies of different regions of papaya ringspot virus coat protein. A purification method uses the aforementioned filler to purify the antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种提高番木瓜环斑病毒抗体特异性的方法
本专利技术涉及用于从抗血清中纯化番木瓜环斑病毒高特异性抗体的方法，属于蛋白分离
和免疫学检测

技术介绍
番木瓜环斑病毒是主要危害番木瓜的主要病毒，能够导致番木瓜出现花叶、环斑、果实畸形和植株早衰等症状，严重影响了番木瓜生产。近年来，人们随着研究工作的深入，发现侵染PRSV存在大量的株系、分离物的变异，这些变异导致不同株系的致病性存在较大差别，其中强致病株能够导致更严重的病症，而弱病毒影响兰花程度较低。再者，随着研究的进一步深入，人们还发现弱病株感染后的兰花能够减缓强病株的感染危害，存在一定程度的交叉保护作用；另一方面，人们在推广抗病转基因番木瓜时发现，转基因番木瓜对不同病毒株系的抗性存在明显的差异，特别是同源性低的株系没有抗性。由此可见，准确鉴定病毒和病毒株系对于防治工作至关重要。目前该病毒的检测主要采用间接ELISA和双抗夹心ELISA等血清学技术，这些技术的准确性主要依赖于检测抗体（IgG）的特异性。检测抗体主要来源是通过将病毒作为免疫原注射到兔、羊、鼠等哺乳动物，从而诱发动物产生特异结合病毒的抗体。进一步采集得到的动物血清就含有大量的病毒抗体，可用于一般的检测工作。不过，为进一步提高抗体特异性，就有必要通过抗体纯化步骤进一步提高抗体的浓度和降低非抗体蛋白的含量。目前能够用于抗体纯化的技术包括：盐析法、辛酸沉淀法、离子交换法和亲和层析法等。其中最常用的是亲和层析法，该方法是利用受体与配体、抗体与抗原的特异性识别结合富集目标产物，其优点是可以通过简单的处理得到纯度较高的目标产物。抗体的亲和层析可以使用ProteinA、ProteinG、抗抗体、抗原等作为配基制备亲和填料，最常见的是采用蛋白A或蛋白G作为配基制备亲和填料。其中蛋白A是金黄色葡萄球细胞壁上的一种蛋白质，能够特异性地与哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合，蛋白G是链球菌细胞壁蛋白，能够与抗体IgG的恒定区、清蛋白、α2-巨球蛋白结合。因此，利用蛋白A、蛋白G的亲和填料纯化得到的抗体属于混合抗体，这种抗体的特异性较差。采用蛋白A、蛋白G亲和层析纯化抗体的典型方法如下：（1）通过功能试剂修饰在填料表面形成NH2或COOH基团，通过戊二醛或双功能基团进一步修饰NH2或COOH得到活化填料；（2）将纯化的蛋白A或蛋白G加入活化填料中，通过共价键结合到填料，制备得到亲和填料；（3）使抗血清粗溶液经过固定蛋白A货蛋白G的填料，使IgG吸附到填料上；（4）用中性的缓冲液冲洗填料，去除其他杂质；（4）使用酸性缓冲液（pH2.5~pH3.0）洗脱吸附在填料上的IgG；（5）调整洗脱液pH值至中性，得到纯化的IgG。另外，还可以采用抗原作为配基制备亲和填料，应用于抗体纯化可以得到亲和力好、特异性强、纯度高的抗体。专利技术（2015103209206）将变性抗原蛋白(如原核表达的包涵体蛋白)直接偶联在固相载体以纯化抗体,简化了操作步骤,即制备可溶性抗原蛋白过程，所得抗体具有极高的纯度和特异性,适合于实验室制备和工业生产中应用。文献封琳等猪瘟病毒抗原与环氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶联，制备成免疫亲和层析柱用于该病毒抗体的纯化，得到纯度高、活性强的病毒抗体。不过，由于采用的是全抗原，纯化得到的抗体识别也属于混合抗体，无法用于病原体株系、分离物的准确鉴定。鉴于此，本专利技术提供了一种能够用于从抗血清中纯化特异性抗体的一系列多肽配基亲和介质，满足抗体纯化的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用PRSVCP氨基酸序列信息，合成一系列多肽片段作为配基偶联到填料制备一系列的亲和填料，替代常规的亲和填料，用于从PRSV抗血清中纯化得到针对不同片段的抗体。该方法能够纯化得到针对病毒特定氨基酸残基的检测抗体，其特异性远高于蛋白A、蛋白G亲和层析纯化的抗体，而且操作简便、对设备要求简单。为了实现该目的，本专利技术的技术方案是：根据PRSVCP氨基酸序列，优选具有一定亲水性、表面可及性或抗原性序列，设计长度为6-30个氨基酸残基的一系列多肽片段；采用氨基硅烷对包括多孔玻璃、玻璃纤维、硅胶、树脂、琼脂糖凝胶、磁性微粒材料、纤维素（如棉花、纤维层析纸）进行氨基化修饰得到氨基修饰填料；采用常规Fmoc或Boc法在上述氨基修饰填料进一步合成连接臂“GnS”（其中n代表G的数量，分别为3-20），其末端带有NH2基团；以上述的表面修饰填料或其它常见带有NH2基团的填料为基材，采用Fmoc法或Boc法进行多肽片段的原位合成得到多肽配基亲和填料；本专利技术也包括采用常规的化学合成得到多肽片段后，通过戊二醛法、活化酯法、碳二亚胺法、琥珀酸酐法和重氮化法或其它常见的偶联法将多肽片段偶联到填料制备得到亲和填料。根据多肽与抗体亲和力较低的特性，在抗体纯化过程中，优选pH3.5-4.5的洗脱缓冲液，从而减少对抗体活性的破坏。本专利技术包括的实验步骤是1）多肽片段的设计：首先根据PRSVCP氨基酸序列保守，选择位于病毒特异保守区的片段；进一步分析这些片段氨基酸残基的亲水性、表面可及性和抗原性；优选包括CP蛋白N端至C端，最短为6个氨基酸长度、最长为30个氨基酸长度的一系列多肽片段。2）填料的氨基修饰：采用0.1%-20%氨基硅烷溶液，加到填料中于室温静置30min-12h进行填料的NH2修饰。采用常规Fmoc或Boc法在NH2修饰的填料上进一步合成连接臂“GnS”。3）多肽片段的原位合成：采用Fmoc法或Boc法在上述表面带有氨基修饰的填料或其它带有NH2基团填料上进行原位合成多肽，所述的多肽是上述优选的多肽。4）多肽片段配基的固定：采用化学合成法进行上述优选的多肽片段的合成后，采用戊二醛法、活化酯法、碳二亚胺法、琥珀酸酐法和重氮化法或其它常见的偶联法将多肽片段偶联到填料同样可以制备到相同的亲和填料。5）抗体的纯化：将抗血清用0.05M-0.2MPBS稀释后，加入到本专利技术制备的一系列亲和填料中静置1-3小时，然后用PBS溶液洗涤去除非特异抗体和其他杂质；再用pH3.0-4.0的甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或其它洗脱溶液进行抗体的洗脱。将洗脱下来的一系列抗体溶液用NaOH、NaCO3等碱性溶液调整pH至中性，透析除盐后得到一系列纯化的抗体。本专利技术的主要优点是通过纯化可以得到一系列针对病毒不同蛋白片段的抗体，而且可以采用较温和的洗脱条件从而保证了抗体的活性。实施实例一为更好的理解本专利技术，本实施实例为PRSVCP“1SKNETADAGL10”多肽片段为例，描述针对该片段的抗体亲和填料的制备方法；并进一步比较了纯化抗体和蛋白A亲和纯化抗体的特异性实验，说明本专利技术亲和填料的优点。下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1材料1.1主要实验设备与耗材玻璃纤维为市场购买；采用3次肌肉注射和1次静脉注射免疫程序，以PRSV为免疫原免疫家兔，测定效价达1:5000后采集兔抗血清。2方法2.1玻璃纤维的表面NH2修饰：取10g玻璃纤维，用浓硫酸和30%双氧水（v/v）3:1浸泡5min，用纯水清洗至中性，120℃热风干燥。待玻璃纤维冷却至室温后，加入5%氨基硅烷无水乙醇溶液浸泡4小时，滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高番木瓜环斑病毒（PRSV）抗体特异性的方法，其特征在于：在填料表面修饰PRSV外壳蛋白不同区域的多肽片段，使其具有能够吸附外壳蛋白不同区域的抗体的特征，替代常规亲和层析填料，进行抗体纯化。

【技术特征摘要】
1.一种提高番木瓜环斑病毒（PRSV）抗体特异性的方法，其特征在于：在填料表面修饰PRSV外壳蛋白不同区域的多肽片段，使其具有能够吸附外壳蛋白不同区域的抗体的特征，替代常规亲和层析填料，进行抗体纯化。2.根据权利要求1所述的多肽片段，其特征在于：所述的多肽片段对应于PRSV...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文珠，郑国华，林德钦，
申请(专利权)人：厦门华侨亚热带植物引种园，
类型：发明
国别省市：福建,35