一种提高IC‑RT‑PCR技术检测能力的方法技术

本发明专利技术提供一种提高IC‑RT‑PCR法检测RNA病毒检测能力的方法，属于免疫学检测技术领域和分子生物学技术领域。该方法通过对PCR管进行活性基团的修饰，使其能够高效吸附抗体和抗原等待测物，克服以往采用未经修饰PCR管存在吸附待测物能力弱的缺点，从而提高了检测方法的稳定性和灵敏度。

A method to improve the detection ability of IC RT PCR Technology

The invention provides a method for improving IC RT PCR assay for detection of RNA virus detection ability, belonging to the technical field of molecular biology and immunological detection technology. By modifying the active group of PCR tube, the method can efficiently adsorb antibodies and antigens waiting for testing substances, and overcome the weakness of the past using unmodified PCR tube to adsorb the tested substances, so as to improve the stability and sensitivity of the detection method.

【技术实现步骤摘要】
一种提高IC-RT-PCR技术检测能力的方法
本专利技术涉及一种能够提高IC-RT-PCR技术检测RNA病毒能力的PCR管修饰方法，属于免疫学检测
和分子生物学

技术介绍
免疫捕获-反转录-聚合酶链式反应（IC-RT-PCR）是利用抗病毒抗体特异吸附样品中的检测目标，再采用RT-PCR进行基因扩增。根据文献[1]所述，该技术具有简便、灵敏的优点，常用于RNA病毒、特别是植物RNA病毒的检测工作。典型的IC-RT-PCR的检测方法如文献[2,3]所描述，首先根据抗体效价（1:1000）用包被缓冲液稀释后，加入100μL到灭菌的未修饰PCR管中，37℃孵育2h或4℃过夜。加入200μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4℃，10000r·min-1离心15min。取100μL上清液加入到上述PCR管中，37℃孵育2h或4℃过夜。PBST洗管3次。进行RNA的释放：在上述管中加入20μL释放缓冲液，65℃水浴10min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。但是由于现有的IC-RT-PCR均采用未经处理的PCR管吸附抗体，主要通过PCR管和抗体间的疏水键进行结合，存在结合力弱、吸附量低等问题，导致检测重复性差、难于定量等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高IC-RT-PCR检测技术能力的PCR管修饰方法。采用以下技术方案：通过硅烷化试剂对PCR管进行表面修饰，使其表面带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐等基团，能够与抗体、抗原形成稳定的共价键，能够提高吸附抗体、抗原的能力，并且在后续洗涤过程中不易被冲洗损失，提高IC-RT-PCR的检测灵敏度和可靠性。所述的硅烷化试剂包括但不限于氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂。所述的修饰对象PCR管，其特征在于：包括但不限于PCR管、PCR联管、96孔PCR板、48孔PCR板、196孔PCR板、384孔PCR板和其它形式的PCR载体。所述的PCR管修饰方法，其特征在于：采用0.1μL-100μL的0.01%-20%硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30min-12h进行修饰。本专利技术的优点是：修饰的PCR管能够提高结合抗体的能力，避免洗涤过程中因pH值、盐浓度等变化导致抗体、抗原的脱落，提高检测灵敏度和重复性。再者，通过控制硅烷化试剂浓度可以控制PCR管吸附抗体和抗原的浓度，从而制备用于检测不同浓度梯度的PCR管，满足不同检测需求。不仅如此，使用修饰的PCR管还可以从低病毒浓度溶液中富集病毒粒体，可用于灌溉水、培养液等含低浓度病毒的样品的检测。具体实施方式本专利技术的目的对IC-RT-PCR检测方法使用的PCR管进行硅烷化修饰，提高PCR管吸附抗体、抗原的能力。通过修饰的PCR管具有更稳定的吸附能力，提高检测灵敏度、重复性和稳定性。为了实现该目的，本专利技术的技术方案是：根据抗体含有的亲水基团，选择带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂，采用不同的浓度和体积添加到PCR管、PCR联管、96孔PCR板、48孔PCR板、196孔PCR板、384孔PCR板和其它形式的PCR载体中，室温静置30min-12h进行修饰，使其PCR载体带有氨基、巯基、羧基或羟基等亲水基团。检测步骤和检测条件同常规的IC-RT-PCR方法。本专利技术包括的实验步骤1）选用带有亲水基团的硅烷化试剂，优选带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐的硅烷化试剂，使用无水乙醇、甲醇、正丁醇等合适溶剂进行配置。2）PCR管于121℃进行湿热灭菌，80℃烘干。3）将0.1μL-100μL的0.01%-20%硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30min-12h进行修饰。4）用双蒸水反复重新5遍，80℃烘干，得到修饰后的PCR管，现用或密封保存。5）抗体的吸附：根据病毒抗体使用浓度，用PBS稀释后，取1~100μL抗体溶液加入到修饰后的PCR管，37℃孵育2h或4℃过夜。加入200μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。6）免疫捕获：取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4℃，10000r·min-1离心15min。取100μL上清液加入到上述PCR管中，37℃孵育2h或4℃过夜。PBST洗管3次。7）RNA的释放：在上述管中加入20μL释放缓冲液，65℃水浴10min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。实施实例一本实施实例为氨基硅烷修饰PCR管为例，描述PCR的氨基修饰方法，并进一步比较使用常规PCR管和氨基修饰PCR管对检测结果的影响。说明本专利技术进行PCR管修饰的优点。下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1材料1.1主要实验设备与耗材(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷和100μLPCR管均为市场购买，抗体和RT-PCR试剂均为常规试剂。2方法2.1用无水乙醇配制0.1%(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。2.2PCR管于121℃进行湿热灭菌，80℃烘干。2.3将5μL的0.1%(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30min进行修饰。4）用双蒸水反复重新5遍，80℃烘干，得到修饰后的PCR管，现用或密封保存。5）抗体的吸附：根据病毒抗体使用浓度，用PBS稀释后，取5μL抗体溶液加入到修饰后的PCR管，37℃孵育2h。加入50μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。6）免疫捕获：取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4℃，10000r·min-1离心15min。取5μL上清液加入到上述PCR管中，37℃孵育2h。PBST洗管3次。7）RNA的释放：在上述管中加入20μL释放缓冲液，95℃水浴2min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。3结果3.1采用修饰PCR管进行IC-RT-PCR能够检测稀释200倍的携带建兰花叶病毒的阳性样品，而未修饰的PCR管的IC-RT-PCR检测到稀释10倍的阳性样品，说明检测灵敏度得到有效提高。3.2采用修饰PCR管进行IC-RT-PCR检测从10个文心兰样品中检测建兰花叶病毒、3次实验的阳性率均为100%。采用未修饰的PCR进行3次的IC-RT-PCR检测，结果从10个样品中分别检测到7、8、7个阳性样品。由此可见，修饰PCR管提高了检测重复性。实施实例二本实施实例为氨基硅烷修饰PCR管为例，描述PCR的氨基修饰方法，并进一步比较使用常规PCR管和氨基修饰PCR管对检测结果的影响。说明本专利技术进行PCR管修饰的优点。下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1材料1.1主要实验设备与耗材N,N-二乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷和100μLPCR管均为市场购买，抗体和RT-PCR试剂均为常规试剂。2方法2.1用无水乙醇配制1%N,N-二乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷。2.2PCR管于121℃进行湿热灭本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高IC‑RT‑PCR技术检测能力的PCR管修饰方法，其特征在于：采用带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂对PCR管进行表面修饰，使PCR管能够吸附抗病毒抗体、病毒粒体。

【技术特征摘要】
1.一种提高IC-RT-PCR技术检测能力的PCR管修饰方法，其特征在于：采用带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂对PCR管进行表面修饰，使PCR管能够吸附抗病毒抗体、病毒粒体。2.根据权利要求1所述的硅烷化试剂，其特征在于：使用的硅烷化试剂为带有能够与抗体、病毒、或其他抗原蛋白结合基团的硅烷化试剂，包括但不限于氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑国华，明艳林，张文珠，林德钦，刘韶松，郑志忠，
申请(专利权)人：厦门华侨亚热带植物引种园，
类型：发明
国别省市：福建,35