一种绞股蓝皂苷TN‑1的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种绞股蓝皂苷TN‑1的制备方法，包括以下制备方法：步骤一、绞股蓝总皂苷的提取；步骤二、绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化；步骤三、酶法转化绞股蓝皂苷XLVI；步骤四、制备绞股蓝皂苷TN‑1。本发明专利技术首次采用酶法转化法，可从绞股蓝中大量制得绞股蓝皂苷TN‑1，使得绞股蓝皂苷TN‑1替代人参皂苷IH901产生重大经济价值，进而提升绞股蓝的抗肿瘤等药用价值，促进绞股蓝的深度开发利用。

A 1 TN gypenosides preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法
本专利技术涉及绞股蓝的
，尤其涉及一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法。
技术介绍
绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino.)，又名七叶胆、五叶参、七叶参和甘蔓茶等，是一种葫芦科绞股蓝属的多年生攀缘植物，系我国民间常用的一种中草药，是现在所知仅有的含有人参皂苷类成分的非人参属植物。据统计，目前全世界上的绞股蓝品种共有17个种2个变种，其中中国有14个种2个变种，主要分布区域为东南亚等地以及我国秦岭及长江以南地区。2002年3月5日，绞股蓝被国家卫生部列入保健品名单，成为药食两用新资源。绞股蓝皂苷(Gypenoside，Gyp)是绞股蓝中的一种主要活性成分，其中，GypXLVI是福建省南靖地区绞股蓝地上部分的主要的绞股蓝皂苷之一，而另一绞股蓝皂苷，GypTN-1的含量则非常低。目前尚未见到有文献对GypTN-1的制备方法和生物活性进行详细的报道，仅发现GypTN-1可以从绞股蓝中直接提取获得，但是得率非常低。参见文献《Dammarane-typesaponinsfromGynostemmapentaphyllum[J].Phytochemistry,2011,72(11-12):1453-1459》；Kim等研究人员从1.085kg的绞股蓝地上部分中，通过甲醇室温浸提3周提取后，采用ODS硅胶柱层析或MCI柱层析，最终获得18mg的GypTN-1，得率仅有0.00166％，因此GypTN-1难以从绞股蓝中直接大量提取。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法，包括以下制备方法：步骤一、绞股蓝总皂苷的提取：将绞股蓝地上部分烘干，粉碎，加入乙醇浸提，浸提液减压浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，石油醚萃取脱脂脱色后再用正丁醇萃取至正丁醇层无色，合并正丁醇层减压浓缩，干燥，制得绞股蓝总皂苷；步骤二、绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化：将所述绞股蓝总皂苷用中压液相反相柱层析，以丙酮-水梯度洗脱，收集洗脱组分，再用凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，收集洗脱组分，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷XLVI；步骤三、酶法转化绞股蓝皂苷XLVI：以柚皮苷酶作为转化酶，酶法转化条件为：pH值为4-6，温度为40-60℃，反应时间12-60h；用乙醇终止反应，减压浓缩、蒸干，制得绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物；步骤四、制备绞股蓝皂苷TN-1：将所述绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物，用适量甲醇充分溶解，经过凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，收集洗脱组分，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷TN-1。作为实施例的优选方式，所述步骤一中，所述绞股蓝总皂苷的提取的具体方法为：将绞股蓝地上部分进行50℃烘干，粉碎，加入体积分数为80％的乙醇浸提3次，料液比为1:4(g/mL)，每次浸提4h，浸提液在40℃下采用旋转蒸发仪浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，再用等体积的石油醚萃取3次，弃石油醚层，水层再用正丁醇萃取3次，弃去下层，合并正丁醇层减压浓缩，45℃下旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥机干燥，制得绞股蓝总皂苷，4℃保存备用；作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化的具体方法为：将所述绞股蓝总皂苷用中压液相反相柱层析，选择丙酮-水作为流动相，流速为40mL/min，按溶液极性从大到小的顺序依次洗脱；第一次过中压液相柱的流动相为：水及25％、50％、75％、100％的体积分数的丙酮水溶液，洗脱体积分别为0.5L、2L、2L、2L、1L；分试管收集洗脱液，从流动相为体积分数为25％的丙酮水溶液开始收集，每管200mL，从将洗脱液通过TLC进行分析，合并第11-14管的组分E；再将组分E进行第二次中压液相柱层析，第二次过中压液相柱的流动相为：水及40％、55％、100％的体积分数的丙酮水溶液，洗脱体积分别为0.5L、2L、2L、0.5L；分试管收集洗脱液，从流动相为体积分数为40％的丙酮水溶液开始收集，每管200mL，从将洗脱液通过TLC进行分析，合并第5-10管的组分E3；用旋转蒸发仪40℃浓缩，备用；再用凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，流速调至10秒/滴，常压过柱，用自动部份收集仪收集各组分，1h收集1管，将洗脱液通过TLC分析，合并第20-40管组分E31，浓缩，备用，制得绞股蓝皂苷XLVI。作为实施例的优选方式，所述步骤三中，酶法转化条件为：pH值为4.16，温度为47.33℃，反应时间60h。作为实施例的优选方式，所述步骤四中，所述制备绞股蓝皂苷TN-1的提取的具体方法为：将所述绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物，用适量甲醇充分溶解，经过SephadexLH-20凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，流速调至10秒/滴，常压过柱，用自动部份收集仪收集各组分，1h收集1管，将洗脱液通过TLC分析，收集第20管组分E312，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷TN-1。由于本专利技术采用了上述的技术方案，使得本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次采用酶法转化法，可从绞股蓝中大量制得绞股蓝皂苷TN-1，经试验，绞股蓝皂苷TN-1得率为0.53％，远大于采用传统的直接提取法的得率，使得绞股蓝皂苷TN-1替代人参皂苷IH901产生重大经济价值，进而提升绞股蓝的抗肿瘤等药用价值，促进绞股蓝的深度开发利用。附图说明图1为本专利技术的绞股蓝皂苷TN-1的1H-NMR图谱；图2为本专利技术绞股蓝皂苷TN-1的13C-NMR图谱；图3为本专利技术绞股蓝皂苷TN-1的DEPT45图谱；图4为本专利技术绞股蓝皂苷TN-1的DEPT135图谱；图5为本专利技术绞股蓝皂苷TN-1的HMBC图谱；图6为本专利技术绞股蓝皂苷TN-1的HSQC图谱；图7为本专利技术绞股蓝皂苷TN-1的COSY图谱。具体实施方式以下给出本专利技术制备方法的实施例，对本专利技术作进一步描述。本专利技术所选用的材料为福建南靖地区的绞股蓝，为公开的生物材料。实施例1绞股蓝皂苷TN-1的制备方法一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法，包括以下制备方法：步骤一、绞股蓝总皂苷的提取：将绞股蓝地上部分进行50℃烘干，粉碎，加入体积分数为80％的乙醇浸提3次，料液比为1:4(g/mL)，每次浸提4h，浸提液在40℃下采用旋转蒸发仪浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，再用等体积的石油醚萃取3次，弃石油醚层，水层再用正丁醇萃取3次，弃去下层，合并正丁醇层减压浓缩，45℃下旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥机干燥，制得绞股蓝总皂苷，4℃保存备用；步骤二、绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化：将所述绞股蓝总皂苷用中压液相反相柱层析，选择丙酮-水作为流动相，流速为40mL/min，按溶液极性从大到小的顺序依次洗脱；第一次过中压液相柱的流动相为：水及25％、50％、75％、100％的体积分数的丙酮水溶液，洗脱体积分别为0.5L、2L、2L、2L、1L；分试管收集洗脱液，从流动相为体积分数为25％的丙酮水溶液开始收集，每管200mL，从将洗脱液通过TLC进行分析，合并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绞股蓝皂苷TN‑1的制备方法，其特征在于：包括以下制备方法：步骤一、绞股蓝总皂苷的提取：将绞股蓝地上部分烘干，粉碎，加入乙醇浸提，浸提液减压浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，石油醚萃取脱脂脱色后再用正丁醇萃取至正丁醇层无色，合并正丁醇层减压浓缩，干燥，制得绞股蓝总皂苷；步骤二、绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化：将所述绞股蓝总皂苷用中压液相反相柱层析，以丙酮‑水梯度洗脱，收集洗脱组分，再用凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，收集洗脱组分，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷XLVI；步骤三、酶法转化绞股蓝皂苷XLVI：以柚皮苷酶作为转化酶，酶法转化条件为：pH值为4‑6，温度为40‑60℃，反应时间12‑60h；用⼄醇终⽌反应，减压浓缩、蒸干，制得绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物；步骤四、制备绞股蓝皂苷TN‑1：将所述绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物，用适量甲醇充分溶解，经过凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，收集洗脱组分，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷TN‑1。

【技术特征摘要】
1.一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法，其特征在于：包括以下制备方法：步骤一、绞股蓝总皂苷的提取：将绞股蓝地上部分烘干，粉碎，加入乙醇浸提，浸提液减压浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，石油醚萃取脱脂脱色后再用正丁醇萃取至正丁醇层无色，合并正丁醇层减压浓缩，干燥，制得绞股蓝总皂苷；步骤二、绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化：将所述绞股蓝总皂苷用中压液相反相柱层析，以丙酮-水梯度洗脱，收集洗脱组分，再用凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，收集洗脱组分，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷XLVI；步骤三、酶法转化绞股蓝皂苷XLVI：以柚皮苷酶作为转化酶，酶法转化条件为：pH值为4-6，温度为40-60℃，反应时间12-60h；用⼄醇终⽌反应，减压浓缩、蒸干，制得绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物；步骤四、制备绞股蓝皂苷TN-1：将所述绞股蓝皂苷XLVI酶法转化产物，用适量甲醇充分溶解，经过凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂，收集洗脱组分，减压浓缩，制得绞股蓝皂苷TN-1。2.如权利要求1所述的一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述绞股蓝总皂苷的提取的具体方法为：将绞股蓝地上部分进行50℃烘干，粉碎，加入体积分数为80%的乙醇浸提3次，料液比为1:4（g/mL），每次浸提4h，浸提液在40℃下采用旋转蒸发仪浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，再用等体积的石油醚萃取3次，弃石油醚层，水层再用正丁醇萃取3次，弃去下层，合并正丁醇层减压浓缩，45℃下旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥机干燥，制得绞股蓝总皂苷，4℃保存备用。3.如权利要求1所述的一种绞股蓝皂苷TN-1的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，所述绞股蓝皂苷XLVI的分离纯化的具体方...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑志忠，明艳林，陈良华，黄雯，郑国华，
申请(专利权)人：厦门华侨亚热带植物引种园，
类型：发明
国别省市：福建,35