利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法技术

本发明专利技术公开了一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24‑26℃发酵培养8‑14天，在发酵第5‑8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质。本发明专利技术通过在发酵中期加入群体感应分子刺激桦褐孔菌的生长，该方法无需引入基因工程菌株或外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中三萜类物质的产量。

Method of induction of three terpenoids from obliquus obliquus using quorum induction molecule

The invention discloses a method for inducing three terpenoids, extraction from Inonotus obliquus by quorum sensing molecules including: activation of inonotusobliquus (Inonotus obliquus) CFCC 83414 access liquid medium, 24 to 26 DEG C Fermentation 8 14 days, 8 days in fifth fermentation the quorum sensing molecules, after fermentation, mycelium and fermentation liquid separation, separation and purification of three terpenoids from mycelium and fermentation liquid after treatment. The invention adds the quorum sensing molecule to stimulate the growth of inphobus obliquus in the middle stage of fermentation. The method does not need to introduce gene engineering strain or additional enzyme, and has simple post-processing. It can effectively improve the production of three terpenoids in inoborus.

【技术实现步骤摘要】
利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法
本专利技术涉及微生物发酵及代谢领域，尤其涉及一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。
技术介绍
桦褐孔菌(Inonotusobliquus)是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日本北海道等北半球北纬40°～50°的地区和我国的黑龙江大兴安岭、吉林长白山一带。从16世纪以来，俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就广泛使用桦褐孔菌来治疗各种疑难杂症，如各种癌症、心脏病和糖尿病等。桦褐孔菌是生长在寒带的木腐菌，引起白桦、银桦、榆树、赤杨的白腐。在木材中的桦褐孔菌菌丝在零下40℃也不会冻死，是极耐寒的种类。桦褐孔菌的形态特征：菌核呈现瘤状(不育性的块状物)，外表黑灰，有不规则沟痕，内部黄色，无柄，直径25～40cm，深色，表面深裂，很硬，干时脆，可育部分厚5mm，皮壳状薄，暗褐色；菌管3～10mm，脆、通常菌管的前端开裂，菌孔每mm6～8个，圆形，浅白色，后变暗褐色；菌肉木柱质，有轻微的、模糊不清的环纹，鲜(明亮)淡黄褐色。孢子呈阔椭圆状至卵状，光滑，9～10μm×5.5～6.5μm，有刚毛。桦褐孔菌含有多糖、三萜类、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。三萜类物质的药理研究成果表明其具有抗肿瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、免疫调节保肝、提高动物免疫力和在胚胎细胞发育过程中的调控作用等多种活性，此外，在抗氧化、抗糖尿病、调节心血管系统等方面均呈现出较好的生物活性。白桦脂酸(Betulinicacid，BA)，又名桦木酸，是一种五环三萜类化合物。广泛分布于多种植物中，如鼠李科的酸枣仁、桦木科的白桦树皮、豆科的皂角刺、蔷薇科的光皮木瓜、五加科刺五加、大戟科重阳木、锦葵科木芙蓉花等。最早分离于生长在非洲东部的鼠李科常绿植物的树皮。在我国，白桦脂酸最丰富的自然资源是白桦树皮。近年研究表明，白桦脂酸具有诸多的生物活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤方面，特别是针对黑色素瘤，有突出的表现。同时还具有作用机制特异、分子质量小、低毒性等优点，有广泛的应用开发前景，是一类很有潜力的药物先导化合物。目前，研究表明，桦褐孔菌中可以分离到三萜类物质。但是，在实验过程中，发现从桦褐孔菌中直接提取三萜类物质时，得到的量非常低，所以希望找到一种更为高效的提高三萜类物质产量的方法。群体感应是当菌体的数量达到一定密度时才能发生的感应现象，指的是在一个特定的环境中当菌体的数量急剧增加时，由它所分泌的信号分子的浓度也会相应升高，当其达到一个阈值水平时，菌体之间就会通过发信号来调整它们的共同行为，对较高的细胞密度作出共同的感应。群体感应分子指的介导在菌体细胞与细胞间信息交流而引发的群体感应过程中的自体诱导物或特殊的、微小的、可扩散的信息素。菌体通过这些群体感应分子时刻监控着它们的生存环境。在菌体数量较少时，分泌的信号分子浓度较低，菌体之间保持着一种沉默寡言或处在不具备攻击能力的状态。但是，当菌体的数量急剧增加的时候，此时的细胞会通过发信号，改变和协调它们之间的行为，共同表现出它们的某些生理特性，从而更有利于整个种群的代谢活动和生理功能。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，该方法无需引入基因工程菌株、外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中三萜类物质，特别是白桦脂酸的产量。一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第5-8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质；其中，所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；所述三萜类物质为白桦脂醇、白桦脂酸、角鲨烯和羊毛甾醇中的至少一种。三萜类物质属于次生代谢产物，主要在桦褐孔菌的代谢过程中产生，桦褐孔菌的发酵周期一般为12天。群体感应分子及其衍生物被证明是一种能增加菌丝体生长和次级代谢产物产量的诱导剂。本专利技术研究发现，在发酵中期加入群体感应分子可有效提高桦褐孔菌中三萜类物质，特别是白桦脂酸的产量。本专利技术中，所述桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CFCC83414。所述桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414活化用的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基可以为市售产品。所述固体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，氯霉素0.01％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。固体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基，混匀，煮沸，分装在玻璃管中，之后在121℃下灭菌20min，灭菌后摆成斜面待其凝固。所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖合成培养基可以为市售产品。所述液体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉0.8％，葡萄糖2％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。液体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖合成培养基，混匀，分装，之后在121℃下灭菌20min。采用此培养基配方，更有利于菌体的生长和代谢。所述发酵温度可以为25℃，发酵时间可以为11-14天，所述发酵方式为三角瓶发酵。发酵培养时，前2-3天转速设为0rpm/min，然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，之后再以150-180r/min的转速培养。先静置2～3天，是因为刚接种后，培养基中菌体较少，所需要的氧气也较少；然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，是因为这个时期，菌体已经在逐渐增多，所以要适当增大转速，以满足其对氧气的需求。之后再以150-180r/min的转速培养，是因为此时其菌体量已经达到其最大值，所以要适当加大转速。这样设置转速，更有利于菌体生长和代谢。所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；优选为法尼醇。预实验中对法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇进行初步的比较，发现法尼醇促进三萜类物质合成的效果较显著。所述法尼醇在加入前，先溶解在DMSO中，然后采用0.22μm的无菌的有机系滤膜过滤除菌。所述法尼醇的加入时间可以为发酵第6-7天。因为此时添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24‑26℃发酵培养8‑14天，在发酵第5‑8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质；其中，所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；所述三萜类物质为白桦脂醇、白桦脂酸、角鲨烯和羊毛甾醇中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法，包括：将活化的桦褐孔菌(Inonotusobliquus)CFCC83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第5-8天加入群体感应分子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到三萜类物质；其中，所述群体感应分子为法尼醇、色醇、对羟基苯乙醇、苯乙醇、茴香脑和香叶醇中的至少一种；所述三萜类物质为白桦脂醇、白桦脂酸、角鲨烯和羊毛甾醇中的至少一种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵采用三角瓶发酵，发酵时间为11-14天；培养时，前2-3天转速设为0rpn/min，然后再以90-110rpn/min的转速培养2-3天，之后再以1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，李豪，吴嘉南，牛永武，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33