本发明专利技术公开了一种同时检测4种火龙果病毒的RT‑PCR方法，包括采用高退火温度的特异性扩增引物序列实现二温式PCR扩增，优化扩增引物的配比，减少PCR扩增小片段的趋势，提高检测方法的准确性。通过常规RNA提取、cDNA合成后，采用本发明专利技术方法能够通过一次PCR实验同时检测4种火龙果病毒的感染情况。达到节约了试剂成本、人工成本和时间成本，为这4种火龙果病毒的快速鉴定、防治等工作提供技术保障。
A RT-PCR method for simultaneous detection of four pitaya viruses
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测4种火龙果病毒的RT-PCR方法
本专利技术涉及一种同时检测4种火龙果病毒的RT-PCR方法，属于植物病毒检测领域。
技术介绍
火龙果是近年来国内广泛引种推广的亚热带水果，目前在台湾、海南、广东、广西、云南、四川、福建等省份已经形成一定的种植规模。不过，由于长期采用扦插繁殖的种苗生产方式，病毒从母株直接传播给种苗，从而导致国内火龙果病毒发生严重。目前已知国内有5种马铃薯X病毒属的成员：火龙果X病毒（PitayavirusX）、蟹爪兰X病毒（ZygocactusvirusX）、仙人掌X病毒（CactusvirusX）、仙人掌X病毒-NTU（CactusvirusX-NTU）和树栖仙人掌X病毒（SchlumbergeravirusX）能够侵染危害火龙果，导致植株茎表面出现系统性斑驳、黄化、褪绿和茎段畸形，植株长势较弱，并且果实小、产量下降等症状，影响果农的经济收益。这4种病毒均属于马铃薯X病毒，基因组间的序列同源性达70%以上，采用RT-PCR方法进行检测时，需要选择特异性高的扩增引物，并且严重控制退火温度才能有效扩增目标病毒基因片段。目前已经有分别针对这5种病毒进行单独检测的RT-PCR检测方法，能够较好的检测病毒的感染情况，但是每检测一种病毒就要单独配制PCR检测体系、进行特定的PCR扩增程序和采用一次电泳分析，不仅步骤繁琐、效率低，而且试剂和人力成本较高，极大影响这些检测技术的推广。本专利技术专利提供了一套快速高效，并能够同时检测火龙果X病毒（PitayavirusX）、蟹爪兰X病毒（ZygocactusvirusX）、仙人掌X病毒（CactusvirusX）、仙人掌X病毒-NTU（CactusvirusX-NTU）的RT-PCR方法，通过常规RNA提取、cDNA合成，采用本专利技术的检测引物混合物在1只PCR管同时进行4种病毒基因片段的二温式PCR扩增，通过低廉的琼脂糖凝胶电泳可以判断1个样品受4种病毒侵染的情况。通过本专利技术的方法可以缩短检测时间、节约试剂和人力成本，为火龙果病毒的检测、防治提供技术保障。
技术实现思路
基于常规RT-PCR技术单次实验检测只能判断1种病毒的感染情况，本专利技术根据4种病毒基因序列的保守性设计4条病毒特异性正向引物和1条通用反向引物，建立了一套能够同时检测4种火龙果病毒的RT-PCR方法，实现节约检测成本和时间的目的。为病毒的快速鉴定、乃至病毒防治提供技术保障。本专利技术的方案如下：本专利技术共采用5条高退火温度的特异性引物，其特征在于5条引物序列如下：CVXNTUf：GCAACACCCGGACTATGCCATCCC；CVXf：GGAGTCCACCCATCTTTGTCCTTTTC；ZyVXf：CTTCCAGACACTAACTGCAGCTCAGC；PiVXf：ATTCAAAGGCAATTCTGCTACCCTGGGA；piVirr：GTTGGAACCCTGTGGGAGGCTAC。其中引物CVXnuf对应仙人掌X病毒NTU基因的5393位点；CVXf对应仙人掌X病毒基因的5588nt位点；ZyVXf对应蟹爪兰X病毒基因的5909nt位点；PiVXf对应火龙果X病毒基因的6138nt位点；piVirr与4种病毒互补。本专利技术采用二温式PCR进行基因扩增，其特征在于采用的退火和延伸温度均为68-70℃,时间为1分钟。如权利要求1所述，本专利技术使用的混合引物配比，其特征在于根据扩增片段的长度进行调整，4条正向引物间的比例为1:1到1:5之间。通过优化从而保证了CVX和CVXNTU2种病毒长片段的有效扩增。具体实施方式实施例1：一种同时检测4种火龙果病毒的RT-PCR方法，包括以下步骤：1、多重RT-PCR引物的设计合成：从Genbank下载4种病毒的基因序列，通过比对分析，选择仙人掌X病毒NTU基因的5393位点；仙人掌X病毒基因的5588nt位点；蟹爪兰X病毒基因的5909nt位点；火龙果X病毒基因的6138nt位点等4个位点均为病毒特有的保守序列区作为正向引物；选择位于3’UTR的设计反向通用引物piVirr，该位点均与4种病毒互补。2、RNA提取和cDNA合成：采用常规的实验方式实现RNA的提取和cDNA的合成。4、同时检测4种火龙果病毒RT-PCR方法的建立：以反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应，总体积为25μl，其中模板1μl，4条正向引物混合物（优化比例混合）和1条反向引物(10μM)各1μl，其它采用常规体系。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火并延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物检测：取6μlPCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶成像分析系统观察。通过电泳可以在样品泳道的1300bp、1000bp、700bp和400bp位置得到目标扩增条带。5、正向引物混合物优化比例：采用不同比例的4条正向引物进行混合，对cDNA进行扩增，通过电泳分析表明CVXNTUf和CVXf浓度要高于其它2条引物（CVXNTUf：CVXf：ZyVXf：PiVXf=1.8:1.6:1.1:1），可以较好防止PCR扩增片段偏好性，有效扩增1300bp和1000bp的扩增条带。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测4种火龙果病毒的方法，其特征在于采用高退火温度的特异性引物混合物扩增4种病毒的特定基因片段；采用二温式PCR进行基因扩增；得到1300 bp、1000 bp、700 bp和400 bp 大小差异明显的4条扩增条带。/n
【技术特征摘要】
1.一种同时检测4种火龙果病毒的方法，其特征在于采用高退火温度的特异性引物混合物扩增4种病毒的特定基因片段；采用二温式PCR进行基因扩增；得到1300bp、1000bp、700bp和400bp大小差异明显的4条扩增条带。
2.如权利要求1所述，本发明共采用5条高退火温度的特异性引物，其特征在于5条引物序列如下：CVXNTUf：GCAACACCCGGACTATGCCATCCC；CVXf：GGAGTCCACCCATCTTTGTCCTTTTC；ZyVXf：CTTCCAGACACTAACTGCAGCTCAGC；PiVXf：ATTCAAAGGCAATTCTGCTACCCTGGGA；piVirr：GTTGGAACC...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑国华，张文珠，明艳林，林德钦，
申请(专利权)人：厦门华侨亚热带植物引种园，
类型：发明
国别省市：福建;35
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