同时检测BVDV、IBRV和BPIV的液相芯片检测试剂盒及其专用引物、偶联探针制造技术

本发明专利技术提供了一种同时检测牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒的液相芯片检测试剂盒及其专用引物、偶联探针。利用本发明专利技术的试剂盒对BVDV、IBRV、BPIV的检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于病毒检测、疫苗生产、犊牛产品质检等领域。

【技术实现步骤摘要】
同时检测BVDV、IBRV和BPIV的液相芯片检测试剂盒及其专用引物、偶联探针
本专利技术属于生物检测
中的兽医动物病原检测，特别是涉及一种能够同时特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛副流感病毒3型(BPIV)的液相芯片检测技术及其试剂盒。
技术介绍
液相芯片检测技术液相芯片检测技术属于高通量的检测技术，最初由美国(Luminex)公司发展起来，该技术综合了流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术，是一种多功能的分析平台，可实现多指标的同时定性和定量分析。该技术具有高通量、灵敏度高、重复性好和节省样品的特点。该技术自20世纪90年代中期发展以来，在病毒检测领域的应用主要集中在病毒核酸抗原和病毒抗体两方面的应用。液相芯片检测系统以流式细胞仪为检测平台，以许多大小均一稳定的微球为载体，微球载体的制作严格按照两种分类荧光染料的不同搭配比例进行，每种染料有10个配比，不同比例间相互组合可将微球分为100种，检测多至100个信号，微球上偶联不同的检测因子，可实现多种试验目的。牛病毒性腹泻病毒(BovineViralDiarrheavirus，BVDV)牛病毒性腹泻病毒主要引起牛的病毒性腹泻病，临床主要表现为发热、粘膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染、咳嗽及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿等，除主要感染牛外，该病毒还可引起羊、猪、鹿和多种野生动物的感染，呈现世界性分布，对各国畜牧业造成巨大的经济损失。牛病毒性腹泻病毒根据是否引起上皮细胞病变可分为两个生物型，致细胞病变型和不致细胞病变型，通常不致细胞病变型要占多数，并且致细胞病变型被认为是由不致细胞病变型基因组突变、重排、插入等原因导致，致细胞病变型可从粘膜病病变的牛只中分离。致细胞病变与毒株毒力之间无直接联系，但几乎所有BVDV强毒株均表现为非致细胞病变型，可引起外周血中白细胞的大量减少，是急性BVDV感染的主要原因。牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisvirus，IBRV)牛传染性鼻气管炎病毒主要引起牛的传染性鼻气管炎，又称为牛的坏死性鼻炎，临床症状主要表现为呼吸困难、流水样鼻涕及其整个气管、呼吸道黏膜出现炎症反应，并可继发其他疾病，如牛的脑膜炎，乳房炎等，还可引起生殖道感染、结膜发炎及全身性感染从而引起流产和死胎。本病在世界范围内广泛流行，给养牛业造成巨大的经济损失。IBRV只有一个血清型，但包括3个亚型，分别为IBRV-1.1、IBRV-1.2a、IBRV-1.2b和IBRV-1.3，各亚型的流行病学和临床表现不完全一致，IBRV-1.1、IBRV-1.2a主要引起呼吸道感染，表现为传染性鼻气管炎，IBRV-1.2b可引起传染性脓疱性外阴阴道炎等，IBRV-1.3则与犊牛的脑炎和胎儿流产有关。亚型1.2毒力较亚型1.1弱，且IBRV-1.1亚型的传播能力最强。牛副流感病毒3型(BovineParainfluenzavirustype3，BPIV-3)牛副流感病毒3型是犊牛肺炎的主要病原之一，还是引起牛和其他反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒，临床症状主要表现为牛的副流行性感冒，又称“运输热”，是一种急性接触性传染病。牛副流感病毒和牛传染性鼻气管炎病毒以及牛病毒性腹泻病毒是引起牛呼吸道综合症的(bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC)主要病原，在对BRDC的预防中，对环境的控制是至关重要的。除此之外，接种疫苗是预防如上疾病的最有效手段。在疫苗生产过程中，为防止牛源原材料中BVDV、IBRV、BPIV外源病毒的污染，对如上病毒的准确、特异、快速的进行检测，以进行品质控制，在疫苗生产监控等方面具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供用于对牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型病原核酸同时进行特异性检测的一种新的高通量检测技术。本专利技术所提供的用于对牛病毒性腹泻病毒病原核酸进行检测的标记引物和探针序列如下：BVDV上游引物的(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，BVDV下游引物(BVDV-Biotin-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，BVDV偶联探针(BVDV-NH2-C12-P)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示。本专利技术所提供的用于对牛传染性鼻气管炎病毒病原核酸进行检测的标记引物和探针序列如下：IBRV上游引物的(IBRV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：4所示，IBRV下游引物(IBRV-Biotin-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，IBRV偶联探针(IBRV-NH2-C12-P)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示。本专利技术所提供的用于对牛副流感病毒3型病原核酸进行检测的标记引物和探针序列如下：BPIV上游引物的(BPIV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：7所示，BPIV下游引物(BPIV-Biotin-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，BPIV偶联探针(BPIV-NH2-C12-P)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示。由上述引物/探针衍生的引物/探针序列也属于本
技术实现思路
。所述衍生序列是指在SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2和/或SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4和/或SEQIDNO：5和/或SEQIDNO：6和/或SEQIDNO：7和/或SEQIDNO：8和/或SEQIDNO：9的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物/探针序列。本专利技术的第二个目的是提供用于同时对BVDV、IBRV和BPIV进行液相芯片检测的试剂盒。本专利技术所提供的液相芯片检测试剂盒，包括上述用于对BVDV、IBRV和BPIV进行液相芯片检测的引物和标记探针。具体来讲，所述试剂盒包括：(1)用于25μL普通PCR反应体系的试剂：一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F/IBRV-F/BPIV-F(20μM)各0.25μL，BVDV-Biotin-R/IBRV-Biotin-R/BPIV-Biotin-R(20μM)各0.5μL，RNA-freeH2O7.25μL，核酸模板2μL。(2)分别用于BVDV/IBRV/BPIV病毒检测的已偶联好相应偶联探针的44/54/14号磁球(购于luminex公司)、SAPE显色液(购于invitrogen公司)和1×TMAC和1.5×TMAC缓冲液。为方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒基因组核酸，所述阴性对照为不含牛病毒性腹泻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒进行液相芯片检测的引物和偶联探针，其中，BVDV上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，BVDV下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，BVDV偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；IBRV上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：4所示，IBRV下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，IBRV偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；BPIV上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：7所示，BPIV下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，BPIV偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒进行液相芯片检测的引物和偶联探针，其中，BVDV上游引物的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，BVDV下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，BVDV偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示；IBRV上游引物的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：4所示，IBRV下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，IBRV偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示；BPIV上游引物的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：7所示，BPIV下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，BPIV偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示。


2.用于对牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒进行液相芯片检测的试剂盒，包括权利要求1所述的用于对牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒进行液相芯片检测的引物和偶联探针。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL普通PCR反应体系的试剂：一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL，TaKaRaExTaqHS0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL，BVDV-F/IBRV-F/BPIV-F(20μM)各0.25μL，BVDV-Biotin-R/IBRV-Biotin-R/BPIV-Biotin-R/(20μM)各0.5μL，RNA-freeH2O7.25μL，核酸模板2μL，引物稀释为20ng/μL，反应体系中最终加量为10ng和5ng。


4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒核酸，所述阴性对照为不含牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。


5.根据权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载了如下操作步骤的说明书：
1)各病毒的偶联探针与对应的各病毒磁球的偶联；
2)提取待测样品的基因组RNA/DNA，以提取的基因组RNA/DNA为模板，在权利要求1所述引物的引导下进行普通PCR扩增检测；
3)用得到的PCR扩增产物与各病毒探针偶联磁球杂交，并进行液相芯片的分析，实现对牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒的定性检测；
所述步骤2)中的25μL普通PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL，TaKaRaExTaqHS0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL，BVDV-F/IBRV-F/BPIV-F(20μM)各0.25μL，BVDV-Biotin-R/IBRV-Biotin-R/BPIV-Biotin-R/(20μM)各0.5μL，RNA-freeH2O7.25μL，核酸模板2μL，引物稀释为20ng/μL，反应体系中最终加量为10ng和5ng；
所述步骤2)中的普通PCR反应条件为：先52℃15min，95℃2min；然后94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；最后终延伸72℃7min。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述操作步骤还包括：
4)结果判...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳杰，陈君彦，刘建奇，王秀明，魏学峰，刘国英，范秀丽，张贵刚，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15