莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法技术

本发明专利技术公开了一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法，该检测试剂盒含有病毒特异性扩增引物对，该病毒特异性扩增引物对用于扩增的目的病毒片段落在莫洛尼鼠白血病病毒基因组的包装信号ψ上，因而待测病毒是否包含荧光标签，对滴度检测都没有影响，并且通过qPCR方法检测到的是感染了细胞并且成功整合的病毒，因而本发明专利技术的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法能够体现出病毒的真实感染活力，且不受细胞基因组DNA提取效率影响，具有检测快速、准确和方便的优点。

Moloney mouse leukemia virus titer test kit and titer test method

【技术实现步骤摘要】
莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法
本专利技术涉及病毒分子生物学领域，尤其是涉及一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法。
技术介绍
莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，MMLV)是逆转录病毒的一种，其基因组为两条相同的正链RNA。病毒感染细胞后，能将其RNA基因组逆转录为DNA以整合到宿主的基因组并稳定传代，因此MMLV能高效的将目的基因(或RNAi)导入小鼠或其他动物的原代细胞或细胞系。由于MMLV的该特性，重组MMLV被广泛应用于基因治疗、肿瘤研究等领域中。重组MMLV在实验室的生产，是将表达载体和辅助包装质粒共转染细胞，在细胞中完成病毒的包装。包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，经过浓缩后得到MMLV产品。所得的病毒可直接用于体外细胞实验，病毒经纯化后也能用于体内实验。病毒产品在使用前需要测定其滴度。目前，对MMLV的滴度检测主要采用荧光滴度法和RT-qPCR法。荧光滴度法是一种能够准确测定MMLV滴度的方法。该方法使用病毒液感染细胞后，通过流式细胞仪检测样本中被成功感染的细胞的比例，能准确反映出病毒滴度以及病毒的实际感染活力。但荧光滴度法只适用于包含荧光标签的病毒，不能测定无荧光标签的病毒，因此限制了该方法的使用。RT-qPCR法可以很快检测出病毒滴度。该方法直接提取病毒的总RNA，随后使用RNA进行RT-qPCR。这种方法可以检测病毒中的核酸含量，以此算出病毒滴度。但是，RT-qPCR法会把含有核酸但是丧失感染活性的病毒颗粒的核酸也计算在内，不能真实准确地反映病毒的真实感染活力，会高估病毒的滴度，因此也限制了该方法的应用。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法，以准确和快速地测定莫洛尼鼠白血病病毒的滴度。一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，含有病毒特异性扩增引物对，所述病毒特异性扩增引物对用于扩增的目的病毒片段包括序列如SEQIDNO.1所示的序列片段、或包括序列与SEQIDNO.1所示序列互补的序列片段、或包括序列与SEQIDNO.1所示序列或其互补序列具有一个或多个碱基缺失、取代或插入的序列片段。在其中一个实施例中，所述病毒特异性扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示、或分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列的对应互补序列。在其中一个实施例中，所述莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒还含有内参扩增引物对，所述内参扩增引物对用于扩增的内参片段包括序列如SEQIDNO.4所示的序列片段、或包括序列与SEQIDNO.4所示序列互补的序列片段。在其中一个实施例中，所述内参扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示、或分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示序列的对应互补序列。在其中一个实施例中，所述莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒还含有已知浓度的目的病毒片段的标准品。在其中一个实施例中，所述莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒还含有已知浓度的内参片段的标准品。一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测方法，使用上述任一实施例所述的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：将莫洛尼鼠白血病病毒转导细胞，转导预定时间后，收集细胞，提取基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板，用所述病毒特异性扩增引物对进行PCR扩增，扩增体系使用SYBRGreen实时荧光PCR反应体系；对扩增产物进行溶解曲线分析，得到病毒滴度。在其中一个实施例中，在将莫洛尼鼠白血病病毒转导细胞之前还包括将莫洛尼鼠白血病病毒溶液梯度稀释的步骤，后续使用梯度稀释的莫洛尼鼠白血病病毒溶液转导细胞。在其中一个实施例中，所述莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测方法还包括对已知浓度的目的病毒片段的标准品进行同提取的基因组DNA同样PCR扩增处理和溶解曲线分析的步骤。在其中一个实施例中，所述PCR扩增的程序为：95℃条件下1分钟，进入循环；95℃条件下15秒、60℃条件下1分钟，共40个循环。莫洛尼鼠白血病病毒载体具有多种骨架类型，结构繁杂，通过研究发现，各骨架之间包装信号区域同源性最高。因此，本专利技术创造性地通过同源序列比较分析，找出了适用于多种载体骨架的目的片段，以此目的片段设计病毒特异性扩增引物对，通用性高。具体地，本专利技术的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法用于扩增的目的病毒片段落在莫洛尼鼠白血病病毒基因组的包装信号ψ上，因而待测病毒是否包含荧光标签，对滴度检测都没有影响，并且通过qPCR方法检测到的是感染了细胞并且成功整合的病毒，因而本专利技术的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法能够体现出病毒的真实感染活力，且不受细胞基因组DNA提取效率影响，具有检测快速、准确和方便的优点。附图说明图1MMLV溶解曲线；图2BMP2溶解曲线；图3为莫洛尼鼠白血病病毒的标准曲线，其中横坐标表示目的病毒片段的拷贝数，纵坐标表示Ct值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数；图4为BMP2内参的标准曲线，其中横坐标表示内参片段的拷贝数，纵坐标表示Ct值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。1.引物设计(1)扩增的目的病毒片段及病毒特异性扩增引物对：MMLV-F1:5’-CGTGGTGGAACTGACGAGTT-3’(SEQIDNO.2)；MMLV-R1:5’-AGGTTCTCGTCTCCTACCAG-3’(SEQIDNO.3)。以MMLV穿梭质粒作模板，扩增的目的病毒片段的序列为：5’-CGTGGTGGAACTGACGAGTTCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGTCCAAAAATCCCGATCGTTTTGGACTCTTTGGTGCACCCCCCTAATAGGAGGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCT-3’(SEQIDNO.1)，长度174bp。(2)内参及内参扩增引物对内参选用BMP2(Homosapiensbonemorphogeneticprote本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，含有病毒特异性扩增引物对，所述病毒特异性扩增引物对用于扩增的目的病毒片段包括序列如SEQ ID NO.1所示的序列片段、或包括序列与SEQ ID NO.1所示序列互补的序列片段、或包括序列与SEQ IDNO.1所示序列或其互补序列具有一个或多个碱基缺失、取代或插入的序列片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，含有病毒特异性扩增引物对，所述病毒特异性扩增引物对用于扩增的目的病毒片段包括序列如SEQIDNO.1所示的序列片段、或包括序列与SEQIDNO.1所示序列互补的序列片段、或包括序列与SEQIDNO.1所示序列或其互补序列具有一个或多个碱基缺失、取代或插入的序列片段。


2.如权利要求1所述的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述病毒特异性扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示、或分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列的对应互补序列。


3.如权利要求1所述的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，还含有内参扩增引物对，所述内参扩增引物对用于扩增的内参片段包括序列如SEQIDNO.4所示的序列片段、或包括序列与SEQIDNO.4所示序列互补的序列片段。


4.如权利要求3所述的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述内参扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示、或分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示序列的对应互补序列。


5.如权利要求1～4中任一项所述的莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，还含有已知浓度的目的病毒片段的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝田，施金秀，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44