一种检测EB病毒的RCA方法技术

本发明专利技术公开了一种检测EB病毒的RCA方法，按照如下步骤完成：（1）标本DNA的提取；（2）RCA，再用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明专利技术锁式探针结合RCA技术是一种检测EB病毒的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号，是一种检测EB病毒的新方法。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检测方面具有独特优势。

A RCA method for detecting EB virus

The invention discloses a RCA method for detecting EB virus. According to the following steps: (1) extraction of DNA from specimens; (2) RCA, then agarose gel electrophoresis of 1%, and observe the electrophoresis results by gel imager. The lock probe combined with RCA technology is a new method for detecting EB virus. It is a new method to detect EB virus by identifying target gene sequences by locking probes and amplifying detection signals by RCA amplification. The method does not need special equipment, simple operation, good specificity and high sensitivity, and has unique advantages in virus detection.

【技术实现步骤摘要】
一种检测EB病毒的RCA方法
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种检测EB病毒的RCA方法。
技术介绍
EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)是从非洲Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的一种病毒颗粒，是疱疹病毒γ亚科嗜淋巴细胞病毒属的DNA病毒，能够在B淋巴细胞中建立起隐性感染，刺激细胞的增生和转化，它与特定的淋巴源性和上皮源性疾病包括Burkitt’s淋巴瘤、霍奇金氏病(HD)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、鼻咽癌(NPC)的发生有密切关系。EBV感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。EBV分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。病毒携带者和病人是传染源。经口密切接触为主要传播途径，发病以15～30岁的年龄组为多，一次得病后可获较持久的免疫力。检测EBV的方法有EB病毒分离法、ELISA法和PCR法。EB病毒分离法虽比较准确，但病毒分离培养困难、耗时长、需要特殊的培养条件；ELISA方法灵敏度高、简单快速，但非特异性较高，常常造成假阳性结果；PCR方法灵敏度高、特异性强，但反应条件要求高，并且也存在一定的假阳性反应。滚环扩增(rollingcircleamplification,RCA)是一种恒温线性扩增技术，以其快速简易、灵敏度高和特异性强等优点受到广泛关注。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。当5’端和3’端与靶序列完全互补时，探针两段在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为RCA扩增提供环形模板，环化后的探针就可通过引物进行滚环复制和支链扩增。反之，若靶序列上存在变异或没有所要检测的目的基因，探针无法被连接成环状，复制也就无法进行。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种检测EB病毒的RCA方法，该检测方法操作简单、检测时间周期短、高特异性和灵敏性，通过滚环复制法，能够检测出EB病毒。本专利技术的技术方案如下：一种检测EB病毒的RCA方法，按照如下步骤完成：(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的DNA；(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlDNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μ链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coliBuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coliDNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×ExonucleaseⅠBuffer2μl和ExonucleaseⅠ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶；(4)RCA扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物是：引物5’-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’SEQNO1；探针是：锁式探针5’-TCACCACCCGGGACTTGTACCCGGACTGTCTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTAGCACAAGCGGGAAGACAACCACAGACACCGTCC-3’，探针的5’端进行磷酸化修饰SEQNO2；捕获探针Biotin-AAGAGGATCAAAACATGCGGACCACCAGCTGGTACTTGACCGAAGSEQNO3。采用上述技术方案，本专利技术通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号，是一种检测EB病毒的新方法。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检测方面具有独特优势。RCA扩增反应的最低检测浓度：用本专利技术的方法检测终浓度分别为5pM、50pM、500pM和5nM的模板，RCA扩增产物电泳结果如图1所示。结果显示，RCA在模板终浓度5pmol/L以上均可见明亮条带，表明RCA的最低检测浓度为5pmol/L。结果提示，循环RCA能较好满足低病毒载量标本的检测。有益效果：本专利技术锁式探针结合RCA技术是一种检测EB病毒的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在低病毒载量检测方面具有独特优势。附图说明图1RCA检测不同浓度的模板电泳结果(第1，2,3,4,5泳道分别代表Marker、终浓度为5nM，500pM，50pM，5pM模板组RCA产物电泳结果)。图2样本进行RCA检测的电泳结果(1泳道为Marker，2，3，4，5,6,7,8,9,10,11,12为第1至11号标本RCA产物组电泳结果)。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的说明：实施例1一种检测EB病毒的RCA方法，按照如下步骤完成：(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的DNA；(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlDNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μ链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coliBuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coliDNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×ExonucleaseⅠBuffer2μl和ExonucleaseⅠ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶；(4)RCA扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物是：引物5’-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’SEQNO1；探针是：锁式探针5’-TCACCACCCGGGACTTGTACCCGGACTGTCTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测EB病毒的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的DNA；(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlDNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer 2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer 2μl和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶；(4)RCA扩增：取步骤(2)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29 Buffer 5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29 DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物是：引物5’‑CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT‑3’SEQ NO1；探针是：锁式探针5’‑TCACCACCCGGGACTTGTACCCGGACTGTCTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTAGCACAAGCGGGAAGACAACCACAGACACCGTCC‑3’，探针的5’端进行磷酸化修饰SEQ NO2；捕获探针Biotin‑AAGAGGATCAAAACATGCGGACCACCAGCTGGTACTTGACCGAAGSEQ NO3。...

【技术特征摘要】
1.一种检测EB病毒的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的DNA；(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlDNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coliBuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coliDNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×ExonucleaseⅠBuffer2μl和ExonucleaseⅠ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱世新，彭焦武，杨晓艳，
申请(专利权)人：湖北朗德医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42