本发明专利技术公开了一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明专利技术通过菜豆来源的环氧水解酶1(PvEH1)进行饱和突变，获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶PvEH1 Z4X4‑59。PvEH1 Z4X4‑59对外消旋间氯环氧苯乙烷(rac‑mCSO)的最终eep，在25℃下从3.1％提高到92.3％，E值从2.6提高至26.5。
A Stereoselective Enhanced Mutant of Epoxide Hydrolase from Bean
The invention discloses a mutant of bean epoxide hydrolase with enhanced stereoselectivity, which belongs to the field of genetic engineering and protein expression. The mutant enzyme PvEH1 Z4X4 59 with enhanced enantioselectivity and stereoselectivity is obtained by saturated mutation of the epoxy hydrolase 1 (PvEH1) from kidney bean. The final eep of racemic m-chloroepichlorophenylethane (rac mCSO) in PvEH1 Z4X4 59 increased from 3.1% to 92.3% at 25 C, and the E value increased from 2.6 to 26.5.
【技术实现步骤摘要】
一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体
本专利技术涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。
技术介绍
环氧化物水解酶(epoxidehydrolases,EHs)能催化外消旋环氧化物的对映归一性水解，将底物完全转化为相应的单一构型，具有具有来源广、对映选择性和区域选择性较高、不需要辅助因子参与、反应条件温和、对环境友好等优点，环氧化物水解酶所介导的较为专一的立体选择性而逐渐走进人们的视野，被认为是一种极具工业应潜力的生物催化剂。环氧化物水解酶(epoxidehydrolases,EHs,EC3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的EHs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，EHs对外消旋环氧化物的对映选择率E决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ees和eep。手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理及毒性等方面的差异，使其在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。对映纯间氯环氧苯乙烷(mCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(mCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体。同时对映纯对氯环氧苯乙烷(pCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(pCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如R型对氯环氧苯乙烷((R)-pCSO)可以用于合成CB1拮抗剂；R型对氯苯乙二醇((R)-pCPED)是NMDA受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pCSO与pCPED的生物化学方法已经被报道。其中，Suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(R)-pCSO，其eep最高可达47％；Karboune等人利用来自重组黑曲霉(Aspergillusniger)的环氧化物水解酶(AnEH)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(R)-pCSO，当转化率达到51％时，ees为87％并保留S型底物；Manoj等人使用两种对映选择性互补的EH(StEH与AnEH)协同水解外消旋pCSO合成(R)-pCPED，eep达到93％。利用EHs催化制备(R)-pCSO与(R)-pCPED与席夫碱催化合成相比，具有eep高，来源清洁，更易分离等优势。由于植物来源的EH更加容易获得且原料也较为廉价，引发了人们的研究兴趣。迄今报道的具有单一对映归一性催化特性的环氧化物水解酶有三种，分别来源于土豆、绿豆和新月柄杆菌。本实验室从菜豆(Phaseolusvulgaris)克隆了一种环氧化物水解酶(PvEH1)，并实现其在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中异源表达。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。随着基因工程技术和高通量筛选技术的发展，对已知的环氧化物水解酶进行定向改造是丰富此类酶的重要途径。通过同源建模分析该酶的蛋白质结构，并通过定点突变技术对PvEH1进行分子改造，提高其对映归一性，将其更好的应用于工业生产。
技术实现思路
为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，本专利技术通过理性设计，获得了立体选择性提高的PvEH1突变体。本专利技术采用全质粒PCR的方法以E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pveh1L105I/M160A/M175I质粒为模板，将第178位氨基酸突变成苏氨酸、第106位氨基酸突变成异亮氨酸、同时将第184位氨基酸突变成色氨酸。获得了立体选择性和催化活性同时提高的突变酶，解决了立体选择性不能满足生产高对映纯环氧化物与邻二醇的需求，为拓宽PvEH1的工业应用奠定了基础。本专利技术的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶PvEH1的突变体，所述突变体含有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶突变体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第五个目的是通过理性设计，以SEQIDNO.3所示酶的氨基酸序列为出发序列，将第178位氨基酸突变成苏氨酸、第106位氨基酸突变成异亮氨酸、同时将第184位氨基酸突变成色氨酸。本专利技术的第六个目的是提供所述突变体的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是以所述突变体为催化剂，制备对氯环氧苯乙烷。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是催化包括间氯环氧苯乙烷在内的环氧化物。本专利技术的有益效果：通过理性设计获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶PvEH1Z4X4-59对外消旋间氯环氧苯乙烷的催化效率。本专利技术制备的突变酶PvEH1Z4X4-59对外消旋对氯环氧苯乙烷(rac-pCSO)的E值从3.6提高至26.5。同时，与野生型相比，PvEH1Z4X4-59对外消旋对间环氧苯乙烷(rac-mCSO)的最终eep，在25℃下从3.1％提高到92.3％。附图说明图1为全质粒PCR的凝胶电泳图。图2为rac-pCSO动力学拆分图。图3为全细胞催化rac-pCSO进程图。具体实施方式实施例1突变质粒的构建1、质粒pET28a(+)-pveh1L105I/M160A/M175I的获得将重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pveh1L105I/M160A/M175I(构建方法参加见论文HuiHY,DieH,XiaoLS,etalDirectedmodificationofanovelepoxidehydrolasefromPhaseolusvulgaristoimproveitsenantioconvergencetowardsstyreneepoxides[J].CatalysisCommunications,2016：32-35)接种于培养基装液量为5mL试管中于37℃、220rpm振荡培养12h。培养结束后，将菌体于13,000rpm下离心1min并收集细胞，利用高纯度质粒小提试剂盒PurePlasmidMiniKit(购于康为试剂有限公司)从E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pveh1L105I/M160A/M175I中提取质粒作为迭代突变的模板，进行质粒pET28a(+)-pveh1L105I/M160A/M175I的构建。2、重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-pveh1(PvEH1Z4X4-59)的构建设计特异性的引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环氧化物水解酶PvEH1，其特征在于，含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种环氧化物水解酶PvEH1，其特征在于，含有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述环氧化物水解酶PvEH1的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.表达权利要求1所述环氧化物水解酶PvEH1的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，包括真菌细胞或细菌细胞。7.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主，表达权利要求1所述的环氧化物水解酶PvEH1。8.一种提高环氧化物水解酶立体选择性的方法，其特征在于，将环...
【专利技术属性】
技术研发人员：王婷婷，张婷，徐雄峰，文正，胡博醇，宗迅成，胡蝶，李剑芳，邬敏辰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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