蛋白、跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白、跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用。本发明专利技术要解决的技术问题是克服现有的小孔径蛋白纳米孔在转运双链核酸时需要外接解旋活性组件的不足。本发明专利技术解决上述缺陷的技术方案是提供了牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶蛋白的截短体E1‑1(306‑577)蛋白和E1‑2(306‑605)蛋白及其变体，以及其同源蛋白的变体可以用于制备含导电通道膜，为本领域提供了一种新的有效选择。

Protein and transmembrane nucleic acid spinning nanopore and its construction method and Application

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a protein and transmembrane nucleic acid spinning nanopore and its construction method and application. The technical problem to be solved by the present invention is to overcome the shortcoming of the existing small pore protein nanopore that needs external unwinding active components when transporting double-stranded nucleic acid. The technical scheme of the invention to solve the above defects is to provide truncated E1_1 (306_577) protein and E1_2 (306_605) protein of bovine papillomavirus double-stranded DNA helicase protein and their variants, as well as variants of their homologous proteins, which can be used to prepare conductive channel membranes, thus providing a new and effective choice for the field.

【技术实现步骤摘要】
蛋白、跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用。
技术介绍
对于生物和化学活性物质的高精准检测是长久以来工业和科研领域共同关注的目标之一，而这需要强健和稳定的传感装置，从α溶血素α-HL蛋白第一次应用于单分子检测领域开始，纳米孔作为一个单分子检测的技术平台已经越来越在发挥着重要的作用。通过分子与分子间的亲和作用(如共价结合或非共价吸引)来结合或“捕获”检测感兴趣的分析物，如组氨酸插入α-HL的β桶状区来特定区分量化镍、铜、以及锌等二价金属离子；利用基因工程手段在孔内腔部位嵌入特殊的配体分子来检测小的有机分子甚至蛋白质片段；在α-HL孔道的117号半胱氨酸上结合铜离子来区别氨基酸构型。除了α-HL以外，已经研究的其他蛋白质通道包括用于检测聚乙二醇的阿拉霉素、当下被广泛应用于高通量核酸测序研究的耻垢分枝杆菌重组蛋白MspA，以及孔道直径在3.6nm允许双链通过的噬菌体phi29DNA包装马达蛋白等。α-HL和MspA这类蛋白纳米孔通常需要其他酶的辅助来完成待测物的检测，限制了其更广泛的应用。对于α-HL纳米孔，从已本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白，其特征在于：(1)为分离的牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶的306‑577位氨基酸构成的蛋白，其序列为SEQ ID No.3所示；或(2)：在为(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸所得的变体。

【技术特征摘要】
2017.01.24 CN 20171006003391.蛋白，其特征在于：(1)为分离的牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶的306-577位氨基酸构成的蛋白，其序列为SEQIDNo.3所示；或(2)：在为(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸所得的变体。2.根据权利要求1所示的蛋白，其特征在于：为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～20个氨基酸所得的变体；优选的，为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～3个氨基所得的与(1)限定的变体。3.根据权利要求1所示的蛋白，其特征在于：为(1)所示限定的SEQIDNo.3所示的氨基酸序列具有75％以上同源性的变体；优选的：为(1)所示限定的SEQIDNo.3所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的变体；更优选的：为(1)所示限定的SEQIDNo.3所示的氨基酸序列具有99％以上同源性的变体。4.根据权利要求1-3任一项所示的蛋白，其特征在于：其包含SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的变体，所述变体包含至少一个如下的突变：(a)第479位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)；(b)第489位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)；(c)第530位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)；(d)第529位为谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)；(e)第525位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)；(f)第504位为天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)，丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(g)第328位为谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(h)第360位为天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(i)第322位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(j)第372位为谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、天冬酰胺(N)；(k)第342位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(l)第334位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(m)第392位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(n)第408位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(o)第396位为亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)；丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；(p)第570位为缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；(q)第574位为色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)；(r)第417位为亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；(s)第421位为缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；(t)第383位为缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；(u)第387位为组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)；(v)第323位为亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；(w)第324位为亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)；(x)第565位为苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；(y)第426位为亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；上述各突变位点的位数是以牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶全长的第1位起算；牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶的全长氨基酸序列参见SEQIDNo.5。5.根据权利要求1-4任一项所述蛋白，所述的变体与氨基酸序列为SEQIDNo.3所示的蛋白功能相同或相似；所述功能相似为可以作为形成多聚体蛋白孔道的单体；所述功能相同为可作为形成孔道的单体，且形成的多聚体蛋白孔道还有解旋酶活性。6.根据前述权利要求1-5任一项所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白是经化学修饰的。7.根据权利要求6所述的蛋白，其中所述蛋白通过下述进行化学修饰：将分子连接到一个或多个半胱氨酸、将分子连接到一个或多个赖氨酸、将分子连接到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端修饰。8.根据权利要求7所述的蛋白，其中所述一个或多个半胱氨酸或一个或多个非天然氨基酸已通过取代被引入到所述蛋白。9.根据权利要求7或8所述的蛋白，其中所述分子为(a)能促进含所述蛋白的纳米孔或含导电通道的膜和目标分析物、目标核苷酸或目标多核苷酸之间的相互作用的分子适配体；或：(b)多核苷酸结合蛋白。10.根据权利要求6-8中任一项所述的蛋白，其中所述连接是通过连接体而实现。11.根据权利要求6-9中任一项所述的蛋白，其中所述分子被连接到所述变体中的一个或多个位点。12.多聚体蛋白，含有两个以上权利要求1～11任一项所述的蛋白作为亚基形成的多聚体蛋白。13.根据权利要求12所述的多聚体蛋白，其特征在于：所述的构成多聚体蛋白的亚基数为4～8个。14.根据权利要求13所述的多聚体蛋白，其特征在于：所述的构成多聚体蛋白的亚基数为6个。15.根据权利要求12～14任一项所述的多聚体蛋白，其特征在于：所述的多聚体蛋白为同源多聚体或异源多聚体。16.蛋白，其特征在于：(1)为分离的牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶的306-605位氨基酸构成的蛋白，其序列为SEQIDNo.1所示；或(2)：在为(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸所得的变体。17.根据权利要求16所示的蛋白，其特征在于：为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～20个氨基酸所得的变体；优选的，为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～3个氨基所得的与(1)限定的变体。18.根据权利要求16所示的蛋白，其特征在于：为(1)所示限定的SEQIDNo.1所示的氨基酸序列具有75％以上同源性的变体；优选的：为(1)所示限定的SEQIDNo.1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的变体；优选的：为(1)所示限定的SEQIDNo.1所示的氨基酸序列具有99％以上同源性的变体。19.根据权利要求16-18任一项所示的蛋白，其特征在于：其包含SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的变体，所述变体包含至少一个如下的突变：(z)第479位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)；(aa)第489位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)；(bb)第530位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)；(cc)第529位为谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)；(dd)第525位为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)；(ee)第504位为天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)，丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(ff)第328位为谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(gg)第360位为天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(hh)第322位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(ii)第372位为谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、天冬酰胺(N)；(jj)第342位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)；(kk)第334位为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿佳，孙柯，逯光文，魏霞蔚，应斌武，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51