一种iCAR-NK细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及基因领域，特别涉及一种iCAR‑NK细胞的制备方法。一种iCAR‑NK细胞的制备方法，嵌合抗原受体编码基因插入到iPS细胞的AAVS1位点，得到的CAR‑iPS细胞分化获得iCAR‑NK细胞。本发明专利技术制备的iCAR‑NK细胞由CAR‑iPS分化获得，iPS细胞可增殖周期长，更便于进行基因修饰。相对于慢病毒感染获得的iCAR‑NK细胞，CAR‑iPS分化获得的iCAR‑NK纯度更高，可以接近于100％；基因插入位点均为AAVS1位点，插入位置明确，安全性更高；由于iPS可近乎无限增殖，因此由CAR‑iPS获得的iCAR‑NK也可近乎无限获得，不受外周血分离影响。

A preparation method of iCAR-NK cells

The invention relates to the field of gene, in particular to a preparation method of iCAR NK cells. A method for preparing iCAR NK cells is described. The chimeric antigen receptor coding gene is inserted into AAVS1 site of the iPS cells, and the resulting CAR iPS cells are differentiated into iCAR NK cells. The iCAR NK cells prepared by the invention are differentiated from the CAR iPS cells, which have long proliferative cycle and are more convenient for gene modification. Compared with iCAR NK cells acquired by lentiviral infection, iCAR NK obtained by differentiation of CAR iPS has a higher purity, which can be close to 100%. The gene insertion sites are AAVS1 loci, which have clear insertion location and higher safety. Because the iPS can proliferate almost infinitely, iCAR NK obtained by CAR iPS can also be obtained almost infinitely, and is not affected by peripheral blood isolation.

【技术实现步骤摘要】
一种iCAR-NK细胞的制备方法
本专利技术涉及基因领域，具体而言，涉及一种iCAR-NK细胞的制备方法。
技术介绍
现有CAR-NK的制备主要是通过慢病毒感染对原代NK细胞进行基因修饰。如申请号为201710025330.X提供了一种CAR修饰的NK细胞的制备方法，构建嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CARNK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CARNK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高表达其特异标志物CD16。如申请号为201710209997.5提供一种CARNK细胞及其制备方法与应用。所述方法包括：S1、将特异性抗体编码基因连接到经改造的CAR骨架的克隆位点区中获得CAR基因，所述经改造的CAR骨架包括依次连接的CD244上膜信号区、克隆位点区、CD244本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种iCAR‑NK细胞的制备方法，其特征在于，嵌合抗原受体编码基因插入到iPS细胞的AAVS1位点，得到的CAR‑iPS细胞分化获得iCAR‑NK细胞。

【技术特征摘要】
1.一种iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，嵌合抗原受体编码基因插入到iPS细胞的AAVS1位点，得到的CAR-iPS细胞分化获得iCAR-NK细胞。2.根据权利要求1所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：构建携带有AAVS1位点附近同源序列和嵌合抗原受体编码基因的donor载体；构建B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体；所述携带有AAVS1位点附近同源序列和嵌合抗原受体编码基因的donor载体、所述B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体转入iPS细胞，筛选得到CAR-iPS细胞；所述CAR-iPS细胞诱导分化得到所述iCAR-NK。3.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述AAVS1位点附近同源序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾雨春，尹乐，谭声江，
申请(专利权)人：北京呈诺医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11