正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法技术

本发明专利技术属于肝干细胞恶性转化技术领域，公开了一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤；所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。本发明专利技术通过沉默TG737、过表达MiR‑10b、沉默miR‑200a和过表达CD44，实现了将正常肝干细胞向肝癌干细胞的恶性转化，从而利用本发明专利技术的诱导方法可以为肝癌的研究提供实验模型，利于肝癌疾病的研究。

【技术实现步骤摘要】
正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法。
技术介绍
肝细胞癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌类型，也是占全球癌症相关死亡原因的第三位。HCC是一个复杂、多步骤的过程与各种遗传因素改变的累积有关。HCC患者虽然可以经过手术切除、消融、化疗栓塞、索拉菲尼等方案治疗，但是由于肿瘤侵袭性高，肝内扩散及肝内转移频繁导致预后效果极差，5年内生存率低于5％。因此，提高对HCC复杂的分子机制的理解对于开发新的治疗策略至关重要。肝干/祖细胞(liverstem/progenitorcells,LSPCs)具有很高的增殖潜能，可能是唯一能在积累一定突变后转化为启动HCC的细胞。LSPCs还可能维持这些突变并将它们传递给子代肝细胞，导致LSPCs的恶性转化为肝癌干细胞(livercancerstemcells,LCSCs)，从而导致HCC启动。大多数癌症是通过基因中突变的积累来实现的，这些基因决定着细胞的增殖、细胞周期、细胞分化和侵袭。可以想象，改变调控细胞周期、细胞增殖、细胞分化和细胞侵袭的编码和非编码基因可能对LSPCs的恶性转化具有显著的影响。有一小部分癌细胞构成了自我维持的细胞库，具有独特的自我更新和维持肿瘤增殖的能力，称为癌症干细胞(CSCs)。CSCs具有与相应正常干细胞相似的基因表达谱和与性质，同时在维持恶性肿瘤增殖、侵袭、转移和复发方面起着决定性作用。越来越多的科学研究表明，CSCs存在于各种人类肿瘤中包括HCC。此外，在某些病理过程中，CSCs可能来自正常干/祖细胞的恶性转化。虽然HCC细胞的确切来源仍然未知，但是过去几年累积的数据表明，由LSCPs转化的LCSCs，很可能代表驱动癌症发展的细胞。因此，利用这种细胞做好相关研究有可能为开发更有效的癌症治疗开辟新的曙光，并可能为开发有效消灭癌症细胞提供机会。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，具体地，涉及正常肝干细胞(WB-F344)向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法。WB-F344细胞系购买自中国科学院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库。本专利技术所采用的技术方案为：一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤；所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。进一步的，四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44。进一步的，所述正常肝干细胞为WB-F344。进一步的，所述诱导方法的具体步骤包括：A、构建可诱导慢病毒载体系统，得到慢病毒载体；A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统，转录因子为TG737和miR200a，得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体；A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统，转录因子为miR10b和CD44，得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体；B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞，挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆，得到肝癌干细胞。进一步的，所述步骤B中，步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括：TG737、miR10b、miR200a和CD44。进一步的，还包括步骤C、肝癌干细胞培养：C1、培养：将步骤B的肝癌干细胞采用Williams'sE培养基培养，得到培养后肝癌干细胞；C2、转染：将培养后肝癌干细胞用加入了慢病毒载体的聚凝胺-基质培养基培养，得到转染肝癌干细胞；C3、克隆：将转染肝癌干细胞用完全培养基依次进行培养，传代培养后，得到传代肝癌干细胞；C4、药物筛选：从传代肝癌干细胞中药物筛选出肝癌干细胞。进一步的，所述步骤C1的具体步骤是：步骤B的肝癌干细胞在12孔板中，以2×105个肝癌干细胞/孔，每孔加入1mL含有质量分数为10％的FBS的Williams'sE培养基。进一步的，所述步骤C2中培养后肝癌干细胞的密度为肝癌干细胞饱和密度的50-70％；所述步骤C2中慢病毒载体为步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带转录因子的慢病毒载体；慢病毒载体的加入量为10ug/孔；聚凝胺-基质培养基的加入量为1mL/孔，每空中聚凝胺的最终浓度为5ug/mL；所述步骤C2的培养时间为12h。进一步的，所述步骤C3的培养的时间为12h；传代培养的时间为48h；传代培养转染肝癌干细胞的比例为1:3。进一步的，所述药物筛选的药物为嘌呤霉素二盐酸盐，所述嘌呤霉素二盐酸盐在每孔中最终的浓度为10ug/mL。本专利技术的有益效果为：本专利技术的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法通过沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44，实现了将正常肝干细胞向肝癌干细胞的恶性转化，从而利用本专利技术的诱导方法可以为肝癌的研究提供实验模型，利于肝癌疾病的研究。附图说明图1是本专利技术的转染组与非转染组细胞形态变化图。图2是本专利技术的转染组与非转染组细胞通过Transwell迁移测定评估细胞的体外迁移能力图。图3是本专利技术的转染组与非转染组细胞计数情况图。图4是本专利技术的转染组与非转染组细胞在球体形成能力中的表示图。图5是本专利技术的转染组与非转染组细胞通过qRT-PCR测量细胞中EpCAM，CD133，ABCG2，CK19，AFP，ALB和c-myc的表达癌症干细胞标志物图。图6是本专利技术的转染组与非转染组细胞通过WB检测E-cadherin，N-cadherin，vimentin等间充质特性相关蛋白表达图。图7是本专利技术的转染组与非转染组细胞异种移植物介导的致瘤性图。图中：A表示非转染组；B表示转染组。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步阐释。一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤；所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。进一步的，四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44。进一步的，所述正常肝干细胞为WB-F344。进一步的，所述诱导方法的具体步骤包括：A、构建可诱导慢病毒载体系统，得到慢病毒载体；A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统，转录因子为TG737和miR200a，得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体；A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统，转录因子为miR10b和CD44，得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体；B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞，挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆，得到肝癌干细胞。进一步的，所述步骤B中，步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括：TG737、miR10b、miR200a和CD44。进一步的，还包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤；所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。

【技术特征摘要】
1.一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤；所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。2.根据权利要求1所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44。3.根据权利要求2所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述正常肝干细胞为WB-F344。4.根据权利要求3所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法的具体步骤包括：A、构建可诱导慢病毒载体系统，得到慢病毒载体；A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统，转录因子为TG737和miR200a，得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体；A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统，转录因子为miR10b和CD44，得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体；B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞，挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆，得到肝癌干细胞。5.根据权利要求4所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述步骤B中，步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括：TG737、miR10b、miR200a和CD44。6.根据权利要求5所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫辉，冯亚星，任丽娜，温旭东，王涛，
申请(专利权)人：刘卫辉，
类型：发明
国别省市：四川,51