本发明专利技术公开了Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL‑84细胞株及其构建方法和应用，该细胞株于2018年7月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018164。该细胞株是由携带人融合基因BCR‑ABL的MSCV‑P210逆转录病毒感染C57bl/6供体小鼠的骨髓细胞，而获得稳定表达BCR‑ABL人原癌基因的原代细胞系，经筛选和培养，获得高致癌性且可稳定遗传的前体B细胞系。再将该体外建系的细胞注入C57bl/6同源受体鼠体内，可用于高效构建原发B‑ALL小鼠模型，且该模型的恶性程度较高，疾病建模速度快，建模成本低，适合用于对难治/复发型B‑ALL的治疗方法评价及费城染色体阳性(Ph+)这部分B‑ALL患者的发病机理研究。
【技术实现步骤摘要】
Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株及其构建方法和应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及Ph+急性B淋巴细胞白血病的疾病模型及其KQBL-84细胞株的构建方法和应用。
技术介绍
急性B细胞淋巴白血病(B-ALL)是一种常见的起源于B淋巴细胞系在骨髓内异常增生的恶性血液肿瘤，其在儿童白血病中所占比例为70％以上，而在成人白血病中所占比例约为20％。异常增生的幼稚B细胞在骨髓大量聚集会抑制正常造血功能，同时也可侵犯骨髓外的组织，如外周血、脾脏、淋巴结、性腺、肝等。随着干细胞移植技术的成熟，以及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)等靶向药物的应用，急性淋巴细胞白血病的治疗效果发生了很大改变，其缓解率和长期生存率都有了明显提高。但是对于难治/复发急性B淋巴细胞白血病仍缺乏有效治疗手段，预后仍较差。白血病细胞株可进行分子遗传学研究、构建动物模型进行研究，能够深入地探索白血病发生、发展和转归的机制，辅助临床早期诊断、治疗并进行药物筛选，有重要的临床和研究价值。然而现有技术中利用白血病细胞株进行动物模型构建时，往往存在针对性差、恶性程度较低、建模速度慢及建模成本高等问题。根据研究发现，在B-ALL中，费城染色体阳(Ph+)性的B-ALL约占15-20％，患者具有基因易位(表现为BCR/ABL基因融合)这一生物学特性。针对Ph+的B-ALL，本申请研制了一种急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株及其构建方法和应用，既可用于难治/复发型B-ALL发病机理的研究，又可以用于临床前评价治疗该疾病的药物或治疗新方法。
技术实现思路
针对以上存在的技术问题，本专利技术提供Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株及其构建方法和应用。本专利技术的技术方案：一种急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株，其由携带人融合基因BCR-ABL的MSCV-P210逆转录病毒感染C57bl/6供体小鼠的骨髓细胞，而获得稳定表达BCR-ABL人原癌基因的原代细胞系，经筛选和培养，获得高致癌性且可稳定遗传的前体B细胞系。本专利技术还提供了一种Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株的构建方法，包括以下步骤：步骤A：从供体C57bl/6鼠中获取正常的骨髓细胞；步骤B：利用携带人BCR-ABL融合基因的MSCV-P210逆转录病毒感染液感染步骤A中获取的骨髓细胞，获得感染后的骨髓细胞；步骤C：将正常受体C57bl/6鼠进行致死性剂量γ辐照处理；步骤D：将步骤B获得的感染后的骨髓细胞经尾静脉注入受体小鼠体内，得到发病小鼠；步骤E：筛选步骤D处理后的发病小鼠中发病严重且伴有胸水的小鼠，并进行流式和病理鉴定；步骤F：分离步骤E鉴定成功的发病小鼠的胸水；步骤G：将步骤F分离得到的胸水经细胞裂解液裂解，收集细胞，再经体外培养筛选后，得到可稳定遗传的细胞株，即KQBL-84细胞株。进一步地，步骤A中的所述骨髓细胞总数不少于5×107个，骨髓细胞总数过少会影响实验的顺利进行。进一步地，步骤B中的所述感染液包括：MSCV-P210病毒49-50wt％、FBS7.0-7.5wt％、WEHI4.5-5.0wt％、100x，1M，PH＝7.4的HEPES0.9-1.0wt％、100×Pencilin/Strep0.9-1.0wt％、500×1mg/mlPolybrene0.15-0.2wt％、1000×1mg/mlCiprofloxacin0.09-0.10wt％。更进一步地，步骤B进一步包括以下步骤：步骤B1：取4mL所述感染液重悬细胞，并转移至6孔板中；步骤B2：37℃，1000g，水平转子离心90min；步骤B3：放置细胞培养箱，37℃，5％CO2，4h；步骤B4：收集步骤B3处理后的细胞至50mL离心管中，并且用2mLPBS润洗细胞培养皿，并将残余的细胞一并进行收集到离心管中；步骤B5：300g，离心10min，去除上清液，用5-10mLPBS重悬细胞，得到感染后的骨髓细胞悬液，并且进行细胞计数，根据细胞总数，将细胞密度调整至5×106个/mL。进一步地，步骤C中所述处理正常受体小鼠的辐照处理方法为：采用11Gyγ-ray的致死照射剂量分两次对受体小鼠进行照射，每次5.5Gy，中间隔3h。低于11Gy照射剂量不够会影响小鼠发病率，而高于11Gy照射剂量则会提高小鼠的死亡率。进一步地，步骤D中的所述受体小鼠处理方法为：用1mL医用注射器，通过尾静脉向每只正常受体小鼠体内注射200μl所述感染后的骨髓细胞悬液。进一步地，步骤G进一步包括：鉴定成功后，取B-ALL发病严重的小鼠的胸水，用10ml红细胞裂解液(RBC)冰上裂解10min，PBS清洗3次，用RPMI1640(10％FBS)加50μM的β-巯基乙醇培养一个月，得到可稳定遗传的KQBL-84细胞株。本专利技术还提供了所述KQBL-84细胞株的三种应用，分别为：(1)用于制造原发性B-ALL肿瘤小鼠模型。(2)用于费城染色体阳性(Ph+)这部分急性B淋巴细胞白血病发病机理的研究。(3)所述KQBL-84细胞用于化疗耐受和靶向药物耐药这部分难治/复发急性B淋巴细胞白血病的治疗新方法临床前评价，例如用于针对靶点CD19的CAR-T细胞治疗的体内评价，针对血液肿瘤开发各种新药临床前评价。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的细胞株是由携带人BCR-ABL融合基因的MSCV-P210逆转录病毒载体感染供体C57bl/6鼠的骨髓细胞，获得稳定表达BCR-ABL基因的原代细胞系，再将该原代细胞注入受体C57bl/6鼠体内，经筛选和培养，获得高致癌性且可稳定遗传的前体B细胞系。可用于构建原发B-ALL小鼠模型，且该模型的恶性程度较高，成模速度快，建模成本低，适合用于难治/复发型B-ALL的治疗评价及费城染色体阳性(Ph+)这部分B-ALL发病机理的研究。附图说明图1为本专利技术的整体流程图及发病小鼠筛选鉴定结果示意图；图2为本专利技术的KQBL-84细胞株的B220抗原表达图；图3为本专利技术实施例2中受体小鼠的外周血(PB)、脾脏(spleen)、骨髓(BM)中流式分析结果图；图4本专利技术实施例3中感染后的受体小鼠经靶向药物治疗的耐药测试结果图。急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株，保藏编号：CCTCCNO:C2018164，保藏日期：2018年7月25日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。具体实施方式本专利技术结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术的实施并不仅限于此。下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。实施例1(Ⅰ)从供体小鼠中收集骨髓细胞1)选取6周龄，体重在24-26g之间的健康C57bl/6小鼠作为供体小鼠，用CO2处死供体小鼠；2)在超净台中，用70％消毒酒精对处死后的供体小鼠腹部进行消毒；3)取供体小鼠两侧的股骨，胫骨，髋骨放在预冷的293T细胞培养基中，293T细胞培养基的配比为DMEM+10％FBS+1％谷氨酰胺+1％双抗+1％非必须氨基酸；4)用10ml注射器吸取足量的293T培养基，用27G1/2针头把骨髓腔中的骨髓细胞冲到50ml离心管中，快速有力上下颠倒充分使得骨髓细胞分成单细胞；5)用10ml移液管把所有的细胞收本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL‑84细胞株，其特征在于，其分类命名为KQBL‑84细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018164。
【技术特征摘要】
1.一种Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株，其特征在于，其分类命名为KQBL-84细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2018164。2.如权利要求1所述的KQBL-84细胞株，其特征在于，其由携带人融合基因BCR-ABL的MSCV-P210逆转录病毒感染C57bl/6供体小鼠的骨髓细胞，而获得稳定表达BCR-ABL人原癌基因的原代细胞系，经筛选和培养，获得高致癌性且可稳定遗传的前体B细胞系。3.一种Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A：从供体C57bl/6鼠中获取正常的骨髓细胞；步骤B：利用携带人BCR-ABL融合基因的MSCV-P210逆转录病毒载体，制备高效价病毒并感染步骤A中获取的骨髓细胞，获得感染后的骨髓细胞；步骤C：将正常C57bl/6受体小鼠进行致死剂量γ辐照清髓处理；步骤D：将步骤B获得的感染后的骨髓细胞经尾静脉注入受体小鼠体内，得到B-ALL的发病小鼠；步骤E：筛选步骤D处理后的发病小鼠中发病严重且伴有胸水的小鼠，并进行流式分析和病理鉴定；步骤F：分离步骤E鉴定成功的发病小鼠的胸水进行细胞体外培养；步骤G：将步骤F分离得到的胸水经细胞裂解液裂解，收集细胞，再经体外筛选培养后，得到可稳定遗传的细胞株，命名为KQBL-84细胞株。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤B中的所述感染液包括：MSCV-P210病毒49-50wt％、FBS7.0-7.5wt％、WEHI4.5-5.0wt％、100x，1M，PH＝7.4的HEPES0.9-1.0wt％、100×Pencilin/Strep0.9-1.0wt％、500×1mg/ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘聪，陈艳，胡以国，李宁，邱强，
申请(专利权)人：贵州师范学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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