一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞及其制备方法和应用。所述制备方法为：首先构建pHAGE‑AFP‑HBsAg重组质粒，然后将重组质粒pHAGE‑AFP‑HBsAg、辅助质粒psPAX2和pMD2G用磷酸钙转染试剂共转染293T细胞，获得AFP‑HBsAg重组慢病毒；随后用AFP‑HBsAg重组慢病毒感染DC细胞获得AFP‑HBsAg修饰的DC细胞，最后将AFP‑HBsAg修饰的DC细胞与CIK细胞的联合培养，得到DC‑CIK免疫细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是严重威胁人类健康的重大疾病，是癌症发病谱中最常见的癌症类型之一，在全球范围内肿瘤相关性死亡因素中排名第三，全球每年有超过60万新发病例。肝癌的发生与乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染密切相关，由于我国是乙肝病毒感染的高发国家，因而我国肝癌发病率远高于世界平均水平，我国每年约有11万人死于肝癌。目前全球乙肝病毒慢性感染者超过3.5亿，其中约1/4可发展为严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞肝癌。乙肝表面抗原(HepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)在HBV感染、病毒颗粒形成、免疫识别、影响宿主细胞正常生理功能等方面发挥重要作用。目前HBsAg与宿主细胞关系的研究主要在于以下几个方面：(1)HBsAgpre-S1区和S区与肝细胞表面受体的识别与鉴定；(2)HBsAg与宿主免疫应答的关系；(3)HBsAg在胞内信号通路中的作用；(4)HBsAg及其变异体在细胞损伤中的作用，及与肝癌发生的相关性；(5)HBsAg干扰宿主的物质代谢和氧化还原反应等正常生理过程，是可能的致病机制之一。在以上研究中，一方面为细胞外HBsAg颗粒通过与细胞识别产生感染，诱导和干扰免疫应答；一方面为细胞内HBsAg在翻译、加工、分泌或降解过程中，通过多种机制干扰宿主正常信号通路和生理过程，产生细胞损伤，导致肝脏疾病甚至肝癌。研究表明，HBsAg不仅以游离形式存在于病人血液中，也存在于乙肝相关肝癌病人的癌细胞表面，提示HBsAg是其重要相关抗原，可作为乙肝相关肝癌的治疗靶点。而甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是肝癌细胞合成的高特异性蛋白质，许多肝癌患者(70％～80％)在发病期间都有AFP基因高表达的特征。AFP是一种胚原蛋白，其基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是在成年人肝细胞恶性转化的早期，肝细胞内的AFP基因重新被激活而大量表达，所以在临床上，AFP被用作诊断肝癌的经典肿瘤标记物和金标准。AFP是肝癌细胞表达的高特异性蛋白质，肝炎病毒是诱发肝癌的关键生物因素，在活动性肝炎或肝硬化后期，血清中可检验出高含量的AFP存在，这是肝细胞向肝癌转化的重要标志。研究表明，AFP是肝癌细胞耐受凋亡诱导的一个关键的靶分子，AFP在细胞外，不仅通过与其受体的作用，激活生长信号的传递，而且AFP在细胞内也能通过抑制凋亡信号的转导和激活生长信号的传递，促使肝癌细胞耐受化学药物和生物药物诱导的凋亡。所以，AFP的抗凋亡作用不仅通过促增殖而且也能通过抑制凋亡信号以及激活生长信号的作用对抗体内细胞因子、化学药物诱导凋亡。相关研究，逐步揭示了甲胎蛋白所隐藏的生物学功能及其作用机制，这是AFP具有信息调节分子样作用和作为靶分子治疗肝癌的新发现，为肝癌的生物治疗提供新的策略，也将为肝癌的药物治疗带来新希望。由于AFP基因在肝癌的演进过程并未发现与耐药相关的任何突变，而是基因表达发生改变，特别是在肝炎病毒的迫胁下其基因如何从关闭到开放的表观遗传修饰改变，不同于突变，表观遗传改变是细胞快速应对环境变化的重要机制。因此，研究AFP基因以及其翻译后的表观遗传修饰改变是探索AFP功能的关键问题，也是探索AFP作为治疗肝癌新靶点的核心问题，对认识肝癌发生、转移、耐药和靶向生物治疗有非常重要的临床意义。肝癌的传统治疗方法包括手术、化疗和放疗，都有严重的副作用和局限性。肿瘤的免疫治疗是近年来发展起来的新的抗肿瘤方法，通过调节患者自身的免疫而达到排斥或者杀死肿瘤细胞的免疫治疗和预防方法。免疫治疗与手术、化疗或者放射等其他抗肿瘤疗法联合使用时，取得了内外联合的抗肿瘤效果。树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，也是唯一能激活初始型T细胞的APC。DC通过摄取肿瘤抗原，发育成熟后在膜上高表达MHCI、Ⅱ类分子，并递呈大量的肿瘤抗原给T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)以激活T细胞。近年来，随着DC疫苗抗肿瘤应用研究的开展，DC疫苗已经成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一。目前DC疫苗的类型主要有肿瘤全细胞抗原致敏的DC疫苗、肿瘤抗原多肽致敏的DC疫苗和基因修饰的DC疫苗等。上世纪九十年代，Schmidt-Wolf报道了细胞因子诱导的杀伤性细胞(Cytokine-InducedKillerCell，CIK)，它是一种来源于人体外周血PBMC(PeripheralBloodMonoclonalCells)的细胞，在体外用多种细胞因子与CD3单克隆抗体共同培养后所获得的以CD3、CD56T细胞为主的异质细胞群，其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志(CD3)，也有自然杀伤细胞表面标志(CD56)，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和自然杀伤细胞非MHC限制性的特点。在随后数年的研究中发现，上述两种细胞，即DC与CIK细胞共培养后，CIK细胞的增殖能力及对肿瘤细胞杀伤能力均大大增强，这种杀伤能力主要依赖同时表达CD3、CD56的T淋巴细胞。二者具有一定的互补作用，联合应用将取得“1+1>2”的疗效，从而发挥协同抗肿瘤作用。传统治疗HBV相关肝癌的DC主要有三种：空负载的DC、病人肿瘤组织裂解物负载的DC。这两种DC都有明显的不足之处：空负载的DC只能表达基础的共刺激因子与粘附因子且不具备特异性；肿瘤组织裂解物负载的DC往往由于抗原负载率低，导致递呈效果不佳，特异性低，疗效不显著。目前在临床上使用的DC-CIK技术常通过电转染、病毒转染、穿膜肽等技术来负载肿瘤抗原，促使DC细胞成熟并有效递呈肿瘤抗原肽，活化CIK，发挥杀伤肿瘤细胞作用。综上所述，对于乙肝病毒相关肝癌的细胞治疗，临床上迫切需要一种既能有效识别乙肝病毒抗原又能敏锐捕捉肝癌细胞信号的APC，将信号传递给高效杀伤细胞，最终将乙肝病毒以及肝癌细胞一网打尽。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞及其制备方法和应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞，其特征在于，首先构建pHAGE-AFP-HBsAg重组质粒，然后将重组质粒pHAGE-AFP-HBsAg、辅助质粒psPAX2和pMD2G用磷酸钙转染试剂共转染293T细胞，获得AFP-HBsAg重组慢病毒；随后用AFP-HBsAg重组慢病毒感染DC细胞获得AFP-HBsAg修饰的DC细胞，最后将AFP-HBsAg修饰的DC细胞与CIK细胞的联合培养，得到DC联合CIK免疫细胞。上述AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)pHAGE-AFP-HBsAg重组质粒的构建：以表达AFP和HBsAg的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞，其特征在于，首先构建pHAGE‑AFP‑HBsAg重组质粒，然后将重组质粒pHAGE‑AFP‑HBsAg、辅助质粒psPAX2和pMD2G用磷酸钙转染试剂共转染293T细胞，获得AFP‑HBsAg重组慢病毒；随后用AFP‑HBsAg重组慢病毒感染DC细胞获得AFP‑HBsAg修饰的DC细胞，最后将AFP‑HBsAg修饰的DC细胞与CIK细胞的联合培养，得到DC‑CIK免疫细胞。

【技术特征摘要】
1.一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞，其特征在于，首先构建pHAGE-AFP-HBsAg重组质粒，然后将重组质粒pHAGE-AFP-HBsAg、辅助质粒psPAX2和pMD2G用磷酸钙转染试剂共转染293T细胞，获得AFP-HBsAg重组慢病毒；随后用AFP-HBsAg重组慢病毒感染DC细胞获得AFP-HBsAg修饰的DC细胞，最后将AFP-HBsAg修饰的DC细胞与CIK细胞的联合培养，得到DC-CIK免疫细胞。2.权利要求1所述AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）pHAGE-AFP-HBsAg重组质粒的构建：以表达AFP和HBsAg的乙肝阳性肝癌患者癌组织样本为模板，设计引物、对AFP基因片段进行PCR扩增，将AFP基因PCR产物双酶切后与慢病毒表达载体连接，然后转化至宿主细胞，再经抗性筛选获得重组质粒pHAGE-AFP；将HBsAg基因PCR产物双酶切后与重组质粒pHAGE-AFP连接，然后转化至宿主细胞，再经抗性筛选获得重组质粒pHAGE-AFP-HBsAg；（2）AFP-HBsAg重组慢病毒的纯化浓缩：提取慢病毒重组质粒pHAGE-AFP-HBsAg、辅助质粒psPAX2和pMD2G，将三种质粒用磷酸钙转染试剂共转染293T细胞，转染48~72h后，收集病毒上清液，经离心、过滤、超速离心后，弃上清，取沉淀用无血清培养基溶解过夜，即得AFP-HBsAg重组慢病毒浓缩液；（3）AFP-HBsAg重组慢病毒感染DC细胞：a．采集外周血，离心，弃上清，取沉淀细胞，加生理盐水使沉淀细胞充分悬浮；b．采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化，获得纯度在90%以上的单个核细胞；c.用AIM-V无血清培养液调整单个核细胞浓度至2x106/ml，置于培养瓶内，37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单个核细胞贴壁，收集贴壁细胞，加入含细胞因子的AIM-V无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；d.每3天半量换液一次，并补足细胞因子；在培养的第5天，加入之前获得的AFP-HBsAg重组慢病毒浓缩液，以MOI=5~10对DC进行感染；e.培养的第7天或第8天，即感染后48h或72h，细胞数量达到1×107个以上，收获AFP-HBsAg修饰的DC细胞；（4）CIK细胞培养：收集上述单个核细胞中未贴壁的悬浮细胞，用CIK无血清培养液调整细胞浓度至1~2x106/ml，加入1000U/ml的重组人IFN-γ继续培养；培养24h后加入100ng/ml的CD3单克隆抗体和1000U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-21000U/ml；培养的第7天或第8天，细胞数量达到1x109个以上，收获CIK细胞；（5）AFP-HBsAg修饰的DC细胞与CIK细胞的联合培养：将AFP-HBsAg修饰的DC细胞和CIK...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡钦勇，
申请(专利权)人：武汉大学人民医院湖北省人民医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42