数字聚合酶保真度测定制造技术

提供的确定聚合酶保真度的方法。在一个实施方式中，该方法包括用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；从溶液中形成多个分区，所述溶液包含缺口填充的质粒和用于检测缺口填充的质粒存在的标记物；检测一个或多个分区中缺口填充的质粒的存在；并且通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比例来确定聚合酶的保真度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】数字聚合酶保真度测定本申请要求2016年4月29日提交的美国临时申请62/329,733的权益，该申请通过引用整体并入本文。
技术介绍
DNA聚合酶用于许多生物技术应用，例如DNA测序和聚合酶链式反应。这些应用需要具有高准确度或保真度的DNA聚合酶。因此，还需要一种测量DNA聚合酶保真度的简单方法。测量保真度的一种常用方法是使用聚合酶填充噬菌体M13mp2lacZα基因片段中的缺口，该片段编码α-肽，一种β-半乳糖苷酶的非活性区段。当准确复制并随后引入带有剩余β-半乳糖苷酶基因的互补拷贝的大肠杆菌中时，功能性β-半乳糖苷酶被重构，导致X-gal和蓝色细菌斑块的水解(参见BebenekK.，KunkelT.A.MethodsEnzymol.1995；262：217-232)。不准确的聚合酶活性可能导致α-肽缺陷，最终导致β-半乳糖苷酶活性降低或消失，由浅蓝色或无色斑块表示。从蓝色/无色斑块比计算错误率，并且可以通过DNA测序确定突变。虽然这种方法被广泛用于评估DNA聚合酶的保真度，但该方法是劳动和时间密集的。还开发了基于质粒的DNA聚合酶测定法(参见KeithB.J.，JozwiakowskiS.K.，和ConnollyB.A.Anal.Biochem.2013年2月15日；433(2)：153-161)。该测定基于在单链区域中含有lacZα报道基因的带缺口质粒。在lacZα侧翼的两个位点处切口，并且在互补竞争物DNA存在下通过热循环除去切除的链用于产生缺口。聚合酶的准确度可以通过在体外复制基因然后将质粒导入大肠杆菌中来确定，该方法的概念类似于上述噬菌体系统的方法。再次根据蓝色/无色斑块比计算错误率。质粒系统在带缺口DNA模板制备步骤上是相对于对噬菌体系统的改进，但蓝色/无色菌落评分步骤仍然是耗时且繁琐的。
技术实现思路
本文公开了确定聚合酶保真度的方法。在一些实施方式中，该方法包括用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；从溶液中形成多个分区，所述溶液包含聚合酶缺口填充的质粒和用于检测缺口填充的质粒存在的标记物；检测一个或多个分区中缺口填充的质粒的存在；并且通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比例来确定聚合酶的保真度。在一些实施方式中，毒素和抗毒素是由缺口填充的质粒中的基因编码的蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是选自β-半乳糖苷酶，荧光素酶和靶特异性蛋白酶的酶。在酶是β-半乳糖苷酶的一些实施方式中，分区包括选自下组的诱导物：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，甲基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，乳糖和乳糖衍生物。在酶是β-半乳糖苷酶的实施方式中，底物选自荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，萘并荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，(9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。在一些实施方式中，用于检测质粒存在的标记物选自荧光团，生物素，由质粒编码的荧光蛋白和由质粒编码的蛋白质。在一些实施方式中，在形成多个分区之前将缺口填充的质粒转化到细胞中，并且每个分区包含用于检测细胞存在的指示剂。在某些实施方式中，指示剂选自荧光蛋白，酶，自发荧光蛋白，活细胞染色染料或核酸酶警报试剂，以及抗生素抗性。在一些实施方式中，荧光蛋白选自mKO荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，红色荧光蛋白，红色荧光蛋白变体和黄色荧光蛋白。在某些实施方式中，缺口填充的质粒包含编码荧光蛋白的基因区段。在缺口填充的质粒在细胞中的一些实施方式中，该方法还包括在一温度下孵育溶液或分区以使细胞生长并在形成分区之前或之后表达酶。在一些实施方式中，细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞和昆虫细胞。在某些实施方式中，缺口填充的质粒处于无细胞表达系统中。在一些实施方式中，该聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述聚合酶是逆反转录酶。在某些实施方式中，质粒选自双链DNA质粒，双链RNA质粒，DNA/RNA杂交质粒和噬菌粒。在使用基于毒素/抗毒素细胞的系统的实施方式中，用于确定聚合酶保真度的方法包括用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中所述缺口填充的质粒包含编码细胞的毒素的基因和编码抗毒素的基因，其中毒素根据聚合酶的保真度是功能性的或非功能性的；将缺口填充的质粒转化到细胞中；形成包含多个转化体和用于检测细胞存在的指示剂的溶液；将溶液平分为第一集合和第二集合；从第一和第二集合中的每一个形成多个分区，其中第一集合包含用于诱导抗毒素表达的诱导物；检测来自第一集合的一个或多个分区中抗毒素中和的毒素和突变毒素的存在以确定转化体的总数并检测来自第二集合的一个或多个分区中突变毒素的存在确定含有突变毒素的分区的数量；从转化体总数中减去含有突变毒素的分区的数量，以确定含野生型毒素的分区的数量；并且通过确定含突变毒素的分区的数量与含野生型毒素的分区的数量的比率来确定聚合酶的保真度。在一些实施方式中，毒素是CcdB并且抗毒素是CcdA。在一些实施方式中，毒素是MazF且抗毒素是MazE。在某些实施方式中，毒素是HicA且抗毒素是HicB。还提供了用于实践主题方法的试剂盒。附图说明图1是显示根据本专利技术的一个实施方式确定聚合酶保真度的方法的流程图。图2显示了可用于根据本专利技术的实施方式的方法和系统的示例性计算机系统的框图。图3描绘了用于测定聚合酶保真度(例如，DNA聚合酶保真度)的“方案1”，如实施例1中所述。图4描绘了用于测定聚合酶保真度(例如，逆转录酶保真度)的“方案2”，如实施例2中所述。图5显示了如实施例3中所述的液滴中细菌生长验证的不同方面。图5A显示了液滴中没有细菌细胞，并且图5B显示了液滴中的细胞生长。图6显示了如实施例4中所述的液滴中β-半乳糖苷酶活性的功能检测和验证的不同方面。图6A和6D显示了用pUC19转化的JM109细胞的液滴，图6B和6E显示了用pET11转化的JM109细胞的液滴，并且图6C和6F显示没有细胞的液滴。图6B显示来自细胞的背景荧光，并且图6C显示由于不存在细胞而没有荧光。图7显示了如实施例5中所述的测定液滴中细胞和β-半乳糖苷酶活性的不同方面。图7A是来自切割的β-半乳糖苷酶底物的信号(例如，FAM信号；Y-轴)对来自切割的核酸酶底物的信号(例如，HEX信号；X-轴)的图。图7B是具有FAM(Ch1)荧光信号和/或HEX(Ch2)荧光信号的液滴数的表。图8描绘了用于测定聚合酶保真度的“方案3”，如实施例7中所述。图9显示了如实施例8中所述的测定液滴中细胞和β-半乳糖苷酶活性的不同方面。图9A是来自切割的β-半乳糖苷酶底物的信号(例如，FAM信号；Y-轴)对来自切割的C12-刃天青底物的信号(例如，HEX信号；X-轴)的图。图9B是具有FAM(Ch1)荧光信号和/或HEX(Ch2)荧光信号的液滴数的表。具体实施方式本文提供了用于确定聚合酶保真度的方法。已发现不需要蓝/无色菌落评分步骤的方法。如本文所述，在分区中实施所述方法(例如，在乳液中的液滴中)。I.定义除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定聚合酶保真度的方法，所述方法包括：用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中所述缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；从溶液中形成多个分区，所述溶液包含所述缺口填充的质粒和用于检测该质粒存在的标记物；检测一个或多个分区中所述质粒的存在；并且通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比率来确定聚合酶保真度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.29 US 62/329,7331.一种确定聚合酶保真度的方法，所述方法包括：用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中所述缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；从溶液中形成多个分区，所述溶液包含所述缺口填充的质粒和用于检测该质粒存在的标记物；检测一个或多个分区中所述质粒的存在；并且通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比率来确定聚合酶保真度。2.如权利要求1所述的方法，其中在形成多个分区之前将所述缺口填充的质粒转化到细胞中，并且每个分区包含用于检测细胞存在的指示剂。3.如权利要求2所述的方法，还包括在某一温度下孵育溶液或分区以使细胞生长并在形成分区之前或之后表达所述蛋白质。4.如权利要求1所述的方法，其中所述缺口填充的质粒处于无细胞表达系统中。5.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是酶并且所述分区还包括所述酶的底物。6.如权利要求5所述的方法，其中所述酶选自β-半乳糖苷酶，荧光素酶，靶特异性蛋白酶和自杀酶。7.如权利要求6所述的方法，还包括用于诱导β-半乳糖苷酶表达的诱导物。8.如权利要求7所述的方法，其中所述诱导物选自异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，甲基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，乳糖和乳糖衍生物。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于检测所述质粒存在的标记物选自荧光团，生物素，由所述质粒编码的荧光蛋白和由所述质粒编码的蛋白质。10.如权利要求2或3所述的方法，其中所述指示剂选自荧光蛋白，酶，自发荧光蛋白，活细胞染色染料，核酸酶警报试剂，和抗生素抗性。11.如权利要求10所述的方法，其中所述荧光蛋白选自mKO荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，红色荧光蛋白，红色荧光蛋白变体和黄色荧光蛋白。12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述缺口填充的质粒包含编码所述荧光蛋白的基因区段。13.如权利要求6所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶的底物选自荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，萘并荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，(9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。14.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是2种蛋白质，并且所述2种蛋白质包括毒素和抗毒素。15.如权利要求14所述的方法，其中所述毒素是CcdB并且所述抗毒素是CcdA。16.如权利要求14所述的方法，其中所述毒素是MazF并且所述抗毒素是MazE。17.如权利要求14所述的方法，其中所述毒素是HicA并且所述抗毒素是HicB。18.如权利要求2或3所述的方法，其中所述细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞和昆虫细胞。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是逆转录酶。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述质粒选自双链DNA质粒，双链RNA质粒，DNA/RNA杂交质粒和噬菌粒。22.一种用于确定聚合酶保真度的试剂盒，所述试剂盒包含：包含编码蛋白质的基因的带缺口的质粒，其中所述蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑旻，孟祥栋，J·z·梅格德，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US