本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种以ＤＮＡ重组技术构建高表达的Ｌ－阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，并涉及利用该基因工程菌所产的Ｌ－阿拉伯糖异构酶合成塔格糖的方法。本发明专利技术公开了高效表达Ｌ－阿拉伯糖异构酶的基因工程菌、以该工程菌所产的Ｌ－阿拉伯糖异构酶作为酶源，由Ｄ－半乳糖催化合成Ｄ－塔格糖。利用本发明专利技术的方法，具有简单，高效，周期短等特点，其固定化Ｌ－阿拉伯糖异构酶能反复利用十次以上，适合于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及以DNA重组技术构建一株高表达L-阿拉伯糖异构酶(L-ambinose isomerase)的基因工程菌，并利用该工程菌所产 的L-阿拉伯糖异构酶转化塔格糖(D-tagatose)的方法。技术背景塔格糖为果糖的同分异构体，广泛存在于自然界中，许多食品(如灭菌牛乳、 超高温灭菌乳、乳粉、热可可、各种干酪、某些品种的酸乳、婴儿配方食品)以 及某些植物、药物中都存在有一定量的塔格糖。纯净的塔格糖为白色无水晶体物质，无臭，熔点134t:，玻璃化温度15'C。 其水溶性很好，溶于水后还会引起沸点升高和冰点降低，但并不吸热，因此不 会产生清凉的口感。塔格糖的甜度为蔗糖的92%，是一种很好的填充型甜味剂。 其甜味特性与蔗糖相似，无任何不良异味或后味。塔格糖在机体内的吸收率较低，不会引起机体血糖水平的明显变化，很适合 糖尿病人食用。研究显示，塔格糖并不会引起健康受试者和II型糖尿病患者空 腹血糖和胰岛素水平的明显变化，并可明显抑制糖尿病患者因摄入葡萄糖所引 起的血糖升高，但对其胰岛素敏感性并无明显作用。另据专利报道，塔格糖可 缓解改善糖尿病的症状，抑制各种并发症的发生。塔格糖进入结肠，被其中微 生物菌群所选择性发酵，促进有益菌增殖，抑制有害菌的生长，起到明显的改 善肠道菌群的作用，是一种很好的益生素(prebiotic)。同时，塔格糖发酵还产生 大量有益的短链脂肪酸(short chain fat acid， SCFA)。研究显示，塔格糖并不会降 低牙斑的pH值，而不会引起龋齿。大量安全毒理学试验显示，塔格糖安全无毒。2001年4月11日，美国FDA批准塔格糖作为GRAS (generally regarded as safe公认 为安全的)用于食品。后来，澳大利亚和新西兰也批准了塔格糖在食品中的应 用。塔格糖的生产， 一般以半乳糖为原料，通过化学方法、发酵法或酶法进行异 构化反应而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到。其中，半乳糖在碱土金属催化下，可以方便的转化塔格糖，转化率约在70% 以上(Beadle J.R.etal.,W092-12263， 1992)。然后经酸中和，纯化得到塔格糖晶 体，产率可达到47.6%。但是本法的异构化过程中，除了生成塔格糖外，还容易 形成山梨糖、甘露糖，果糖等杂质，而这些杂质极难与塔格糖分离，需反复结 晶才能去除。发酵法生产塔格糖一般采用乳酸菌，如丄acto6acz7/wj ; /a"tomm，丄acto6acz7/us pe"toM，在适宜的培养中发酵12h以上，对半乳糖也有一定的转化(潘蓓蕾等， CN1948500A, 2007)。但是本法存在发酵周期长，产物浓度低，转化率小等缺点， 不宜工业化生产。酶法转化塔格糖又分为以半乳糖为原料和以半乳糖醇为原料的方法。采用 L-阿拉伯糖异构酶可以很方便的将半乳糖转化塔格糖，所用的酶一般均为重组 的基因工程酶。如专利文献WO00-68397公开了大肠杆菌JM105/pTC101，以10% 的半乳糖为底物，反应168小时，塔格糖的转化率可达30%左右。文献报道了一 种将定点诱变的来自于Geo^"7/ws s/eflra^^mc;pMws的L-阿拉伯糖异构酶重组 到大肠杆菌中，并得到大量表达，以10mmol/L的半乳糖在6(TC度反应10h，最高 转化率可达40。/o(Kim H丄，et al., Journal of Applied Microbiology, 2006,101,: 213-221)。以半乳糖醇为原料，以鄉co6acfen.w附s/weg附a"s或尺/e6wW/a p"e"附o"^e中所产的半乳糖醇脱氢酶为催化剂也可以生产塔格糖(Izumori K., etof Fermentaion Technology, 1988， 15: 105-108; Shimonish T" et al.， Journal of Fermentation Technology, 1995,79: 620-622)。但是，半乳糖醇本身就比 塔格糖价格贵得多，也不太适合于塔格糖的生产。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题之一是公开一种重组L-阿拉伯糖异构酶的工程菌。本专利技术需要解决的技术问题之二是公开一种用重组L-阿拉伯糖异构酶的工 程菌生产的L-阿拉伯糖异构酶的方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是公开一种用酶法转化半乳糖为D-塔格糖 的方法，以克服目前工艺的缺陷，以便适用于工业化生产。本专利技术的构思是这样的正常大肠杆菌并不向培养基中分泌L-阿拉伯糖异构酶，菌体所含的L-阿拉伯 糖异构酶活性也极低，不太适用于D-塔格糖的生物转化。本专利技术采用分子生物 学手段提高大肠杆菌L-阿拉伯糖异构酶的产量及活性，这是酶法转化半乳糖为 D-塔格糖的重要步骤。本专利技术的技术方案如下本专利技术提供了一株重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E co/f BL21/pET-araA。利用重组DNA技术构建L-阿拉伯糖异构酶表达载体，并转化至大肠杆菌， 得到高效表达L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌。L-阿拉伯糖异构酶基因序列来源不受限制，只要能由D-半乳糖催化生成D-塔格糖均可以，例如大肠杆菌(五^/^^/2/"0//)、珠状嗜热脂肪芽孢杆菌(^"7/附s加raf/zem7o/ M附)、产气气杆菌"m)6fl"er aerage"as)、海栖热袍菌(77ze/7wotoga mw仏'm力等。本发一个优选的实施例中L-阿拉伯糖异构酶基因序列来自于大肠 杆菌、人工合成或者通过PCR克隆之。构建L-阿拉伯糖异构酶基因的重组载体也不受限制，只要能高效表达L-阿拉 伯糖异构酶即可，如常用的商用质粒pUC18、 pUC19、 pBV220、 pBR322、 pET 系列等。本专利技术一个优选的实施例中所使用的质粒为pET28a (购自Novagen公 司)，此质粒可在大肠杆菌中稳定存在，且在IPTG或乳糖诱导下可大量表达L-阿拉伯糖异构酶。一种用重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌五.co/!'BL21/pET-araA制备L一阿 拉伯糖异构酶的方法，包括步骤(a)培养所说的大肠杆菌五.co"BL21/pET-araA， 并(b)从培养液中回收所说的L一阿拉伯糖异构酶。微生物培养所需的培养基一般应包括碳源、氮源、无机盐等。所说的碳源可 为葡萄糖、果糖、糊精、蔗糖等，所说的氮源可为玉米浆、蛋白胨、酵母膏、 牛肉膏、大豆水解液、尿素等，所说的无机盐可为氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、 磷酸盐等。优选的用重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌五.BL21/pET-araA制备L一 阿拉伯糖异构酶的方法，其中培养大肠杆菌五.co/ZBL21/pET-araA的培养基为LB 培养基，配方如下蛋白胨10g，酵母粉3g和氯化钠10g， 50pg/ml卡那霉素，加 水至一升，用2mol/L的氢氧化钠调节pH为7.0，对于固体培养基只须再入20g琼脂 即可。更优选的用重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌五.BL21/pET-araA制备L —阿拉伯糖异构酶的方法，其中培养大肠杆菌五.②//BL21/pET-araA的培养基为 LB培养基，配方如下蛋白胨10g，酵母粉3g和氯化钠10g， 50pg/m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株重组Ｌ－阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＥＴ－ａｒａＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁庆豹，欧伶，许彦梅，葛丛涛，王栋，
申请(专利权)人：上海斯贝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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