本发明专利技术涉及一种新的含前Ｓ抗原决定簇的乙肝表面抗原颗粒，该颗粒包括羧端含前Ｓ１抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽（ＳＳ１）和羧端含前Ｓ２抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽（ＳＳ２）。该颗粒以与天然乙肝表面抗原结构类似的球形颗粒形式存在，能在酵母细胞中高效表达，并同时具有前Ｓ１、前Ｓ２和Ｓ三重抗原性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的乙肝表面抗原复合颗粒，具体地说，涉及包含有通过基因工程方法获得的羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS1)和羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS2)的乙肝表面抗原复合颗粒。本专利技术还涉及包含上述融合多肽编码基因的重组载体、重组菌株及制备该复合颗粒的方法。
技术介绍
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，在全世界广泛流行，是一种严重危害人民健康的疾病。据统计，我国约10％的人口为乙肝表面抗原(HBsAg)携带者，其中慢性乙型肝炎患者约1000万人，年发病率约158/10万。目前对乙型肝炎还缺乏有效的治疗方法，进行乙型肝炎疫苗免疫接种是预防和控制乙型肝炎唯一有效的途径。乙型肝炎疫苗的发展经历了三个阶段。最早的乙型肝炎疫苗是从乙肝病毒携带者血浆中分离的乙肝表面抗原颗粒制成的，由于血浆来源有限，加之成本和安全性方面的考虑，这类疫苗在我国已停止使用。目前国内外广泛使用的是重组酵母或CHO细胞产生的由乙肝病毒表面抗原主蛋白(S)构成的重组基因工程疫苗。与血源疫苗相比，基因工程疫苗成本较低，安全性更好，已取得了很好的免疫效果。但这种单S的重组疫苗也有诸多不足，如免疫程序过长，乙肝病毒突变株导致的免疫逃逸及部分人群无应答或低应答等。因此，开发免疫原性更好、价格更为低廉的新型疫苗(第三代乙肝疫苗)仍有其紧迫性。乙肝病毒包膜蛋白含有大蛋白(L)，中蛋白(M)和主蛋白(S)三种成分，其中S蛋白由226个氨基酸组成，在S蛋白之前，有一个由119个氨基酸组成的前S1(preS1)区和由55个氨基酸组成的前S2(preS2)区，其中，PreS2和S一起构成中蛋白，preS1和M一起构成大蛋白。研究表明，preS2含有B细胞和T细胞识别位点(Met1-Gly26)，在对S抗原遗传性无应答的小鼠中诱导出针对preS2的T细胞应答即可使小鼠对S抗原产生抗体应答(Milich DR，Thornton GB，Neurath AR，et a1.Enhancedimmunogenicity of the preS region of hepatitis B surface antigen.Science，1985，2281195-1199.)。PreS抗体可能还在阻止病毒进入细胞时起作用，因为preS1含肝细胞结合位点(aa21-47)，preS2含多聚人血白蛋白(HAS)结合位点，而HAS能与肝细胞结合从而介导病毒对肝细胞的侵入(Machida A，Kishimoto S，Ohnuma H et al.Apolypeptide containing 55 amino acid residues coded by the pre-S region of hepatitis Bvirus deoxyribonucleic acid bears the receptor for polymerized human as well aschimpanzee albumins.Gastroenterology，1984，86910-918.)。有研究显示，preS1、preS2抗血清能够分别中和乙肝病毒的毒力，保护大猩猩免受乙肝病毒感染(Pride MW，Bailey CR，Muchmore E et al.Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzeesimmunized with HepageneR，a hepatitis B vaccine containing pre-S1，pre-S2 and S geneproducts.Vaccine，1998，16543-550.)。因此，在疫苗中加入前S成分不但使S抗原本身的免疫原性得到增强，还增加了抗体谱，从而进一步提高了保护效率。乙肝表面抗原大蛋白虽然含有preS1、preS2和S三种抗原成分，但其内部含有多个蛋白酶敏感位点，易于降解；亦不能有效组装成颗粒样结构(Imamura T，Araki M，Miyanohara A，et al.Expression of hepatitis B virus middle and large surface antigengenes in Saccharomyces cerevisiae.Journal of Virology 1987，3543-3549.)，难以作为疫苗成分加以利用。为了有效表达乙肝表面抗原大蛋白，人们尝试了多种方法对其进行修饰，如俞贤明等采用部分缺失的前S序列与S序列相连的方法，在动物细胞和酵母中表达出了颗粒样的含前S区的乙肝表面抗原(中国专利CN 1063343C)。李光地等将前S1序列融合于S蛋白1-223位氨基酸的羧端并同时在S蛋白N端融合了前S2序列，构建出了前S2+S+前S1的结构(中国专利CN 1067721C)。由于前S2和S基因均含有各自的翻译起始位点，上述结构在翻译过程中会分别从前S2和S蛋白起始，产生两种翻译产物，从而降低了前S组分的比例。而且上述两种构造的表达量都比较低，在实际应用方面有一定的限制。比利时的史密丝克莱恩公司将修饰的L基因与S基因在酵母中进行混合表达(美国专利6103519；美国专利6306625)，得到了含前S成分的乙肝表面抗原颗粒，但这种方法需要进行多次转化、多次筛选才能完成，过程比较复杂，而且混合颗粒需要以单独的S蛋白作为骨架，导致前S组分的比例偏低。
技术实现思路
为了增强乙肝疫苗的免疫原性，增加抗体谱和稳定性，同时使抗原能够在宿主细胞中高效表达，本专利技术的一个目的在于提供一种新的乙肝表面复合颗粒，其特征在于，该颗粒包含羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1和羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2。所述的乙肝表面抗原复合颗粒由羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1亚基与羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2亚基装配而成。所述的羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1含有SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。所述的羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1由SEQ ID NO.1所述的基因编码。所述的羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2含有SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列。所述的羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2由SEQ ID NO.4所述的基因编码。在本专利技术的一个实施方案中，具有乙肝表面抗原S和前S2抗原性的多肽(蛋白)由SEQ ID NO.4编码，具有SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列。本专利技术的另一目的是提供含有SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的重组载体，在本专利技术的一个具体实施方案中，构建了含有SEQ ID NO.1以及SEQ IDNO.4所述核苷酸序列的重组载体pAO815-SS1/SS2。本专利技术的又一个目的是提供一种重组乙肝疫苗的制备方法，通过将所述重组载体转化宿主细胞，获得转化体，培养所述转化体获得表达的重组乙肝表面抗原融合蛋白，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗，所述的宿主细胞为酵母菌。本专利技术还提供一种重组乙肝疫苗，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙肝表面抗原复合颗粒，其特征在于，该颗粒包含羧端含前Ｓ１抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽ＳＳ１和羧端含前Ｓ２抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽ＳＳ２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭昌耀，蒋丽明，葛永红，袁进，金瓯，
申请(专利权)人：成都生物制品研究所，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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