本发明专利技术涉及CD‑133‑CAR‑T系统构建技术，特别是涉及一种基于PiggyBac载体的CD‑133‑CAR‑T系统构建方法，其是通过设计合成CD‑133‑CAR基因片段，然后将CD‑133‑CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac‑CAR‑CD‑133，再将Piggybac‑CAR‑CD‑133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac‑CAR‑CD‑133和Piggybac Transposase到T淋巴细胞，得到带有CD‑133‑CAR基因片段的T淋巴细胞。本发明专利技术采用非病毒类载体PiggyBac系统，避免了使用病毒载体存在的安全隐患，具有更高的安全性和有效性，更加适用于临床治疗；采用的Nucleofector细胞核技术，能够将外源基因直接导入到细胞核，克服了脂质体转染和普通电穿孔，必须依赖细胞分裂时才有可能使外源基因入核表达的缺陷，细胞具有更高的存活率和增殖效率。
【技术实现步骤摘要】
一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法
本专利技术涉及CD-133-CAR-T系统构建技术，特别是涉及一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法。
技术介绍
CAR-T（ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰T细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放（如IL-7，IL-15）激活等；V代，通用型CAR。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。CD133是五肽跨膜糖蛋白成员之一，首次在CD34birght造血干细胞和小鼠的神经上皮干细胞中发现并分离，之后的研究发现肿瘤起始细胞群里含有大量的CD133阳性的细胞，同时CD133在干细胞和多种组织肿瘤干细胞表面作为独立表达的特异标记分子，其中包括脑瘤、胰腺癌、胆管细胞型肝癌（CCA），非小细胞肺癌(NSCLC)，小细胞肺癌（SCLC）、结肠癌和肝癌等。众多研究表明，CD133高表达与肿瘤的自我更新、分化潜能、信号转导调控、药物耐受、复发和预后等均有相关性。由于以上特性，CD133抗原是以抗体为基础的CAR-T免疫治疗的理想靶点。有报告显示，针对超过90%的肿瘤细胞表达CD133蛋白的胆管细胞型肝癌（CCA）患者，采取CAR-T-CD133T细胞免疫治疗疗效显著，该名患者的腹膜和腹腔转移灶出现明显萎缩和消失，无进展生存期（ProgressFreeSurvival,PFS）达到4.5个月。尽管如此，该治疗仍有许多环节需要改进，如能否找到更好的受体、更好的载体、更好的协同刺激分子等，其中转染载体的安全性和有效性对于临床治疗尤为关键。现今，CAR主要的转染模式包括，慢病毒、逆转录病毒、电转染等方式，病毒载体尽管具有较好的转染效率，但存在因基因组整合引起插入突变的风险，因此，利用非病毒载体结合电转技术，不需要病毒的介入，可获得与病毒感染效率相当甚至更高的转染结果，避免了病毒核酸随机插入宿主细胞，影响细胞正常生长以及后续可能的病变，是提升CAR-T细胞疗法的安全性的重要环节。PiggyBac(PB)系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。作为一种新的转基因手段，PiggyBac系统具有许多优势：(1)、与病毒载体相比有安全性高、操作方便、成本低等优点；(2)、整合效率高及更高的目的基因表达概率；(3)、负载容量大，更大的目的片段的插入，可实现多基因的共表达；(4)、转基因可长期稳定地表达，转座后没有引起染色体重排等不稳定现象；(5)、更“精确”拷贝数的插入；(6)、再次转座后可自由移除插入片段，实现精确切离；(7)、可用非损伤性的可见标记代替PCR等传统方法在活体中跟踪转基因；(8)、宿主范围广，转座效率高，且基本不依赖于宿主因子。因此，PB转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具，也是一种较为理想的非病毒类基因治疗载体。基于上述的优势，利用PiggyBac载体构建CD-133-CAR-T势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法；本专利技术的另一个目的是提供一种基于PiggyBac载体构建的CD-133-CAR-T系统在制备用于治疗癌症药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术的的第一个方面是提供一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其是通过设计合成CD-133-CAR基因片段，然后将CD-133-CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac-CAR-CD-133，再将Piggybac-CAR-CD-133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和PiggybacTransposase到T淋巴细胞，所述方法包括以下步骤：步骤一，CD-133-CAR基因片段设计合成，查找CD-133的单链抗体可变区基因片段序列，并根据PiggyBac载体的的特性，设计合成包括对CD-133抗原具有特异性的单链抗体片段scFv、myc-tag、CD8来源的跨膜铰链、共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ来源的基因片段，得到CD-133-CAR基因片段；步骤二，带有CD-133-CAR片段的PiggyBac载体构建，采用酶切、连接和转化的方法，将步骤一得到的CD-133-CAR基因片段连接到PiggyBac载体上，得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac-CAR-CD-133；步骤三，CD-133-CAR基因检测和筛选，通过基因测序的方法来检测步骤二合成的得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac载体，CD-133-CAR基因序列是否正确，得到带，CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133；步骤四，带有CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133扩增，将步骤三得到的带有CD-133-CAR基因的Piggybac载体转入到大肠杆菌中，使带有CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133在大肠杆菌中大量扩增；步骤五，大肠杆菌中质粒提取，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取步骤四中大肠杆菌的质粒DNA；步骤六，带有CD-133-CAR基因的T淋巴细胞构建，从人血清中分离淋巴细胞，并加入T淋巴细胞培养液，INF-γ，OKT-3、hIL-2和步骤五得到的质粒DNA进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和PiggybacTransposase到T细胞中，得到带有CD-133-CAR基因的T淋巴细胞。优选地，所述Piggybac载体为pMD18-Tsimplevector。优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌感受态TOP10。优选地，所述CD-133-CAR基因片段的序列为SEQIDNO.2。优选地，所述Piggybac-CAR-CD-133的基因序列为SEQIDNO.1。本专利技术的另一个方面是提供一种基于PiggyBac载体构建本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于PiggyBac载体的CD‑133‑CAR‑T系统构建方法，其特征在于，其是通过设计合成CD‑133‑CAR基因片段，然后将CD‑133‑CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac‑CAR‑CD‑133，再将Piggybac‑CAR‑CD‑133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac‑CAR‑CD‑133和Piggybac Transposase到T淋巴细胞，得到带有CD‑133‑CAR基因片段的T淋巴细胞。
【技术特征摘要】
1.一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，其是通过设计合成CD-133-CAR基因片段，然后将CD-133-CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac-CAR-CD-133，再将Piggybac-CAR-CD-133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和PiggybacTransposase到T淋巴细胞，得到带有CD-133-CAR基因片段的T淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一，CD-133-CAR基因片段设计合成，查找CD-133的单链抗体可变区基因片段序列，并根据PiggyBac载体的的特性，设计合成包括对CD-133抗原具有特异性的单链抗体片段scFv、myc-tag、CD8来源的跨膜铰链、共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ来源的基因片段，得到CD-133-CAR基因片段；步骤二，带有CD-133-CAR片段的PiggyBac载体构建，采用酶切、连接和转化的方法，将步骤一得到的CD-133-CAR基因片段连接到PiggyBac载体上，得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac-CAR-CD-133；步骤三，CD-133-CAR基因检测和筛选，通过基因测序的方法来检测步骤二合成的得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac载体，CD-133-CAR基因序列是否正确，得到带，CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133；步骤四，带有CD-133-...
【专利技术属性】
技术研发人员：马晓冬，刘明，林展雯，李浔，黄行许，
申请(专利权)人：马晓冬，
类型：发明
国别省市：广东,44
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