瞬时过表达编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因的可消耗的低温保存的细胞制造技术

本发明专利技术公开了用于筛选药物候选物的低温保存的重组细胞，所述重组细胞瞬时过表达一种或多种药物转运蛋白和/或药物代谢酶。有利地，这样的细胞提供成本效率的可消耗产品，其流水线化筛选药物候选物是否是药物转运蛋白和/或药物代谢酶的底物或抑制剂的过程。

【技术实现步骤摘要】
瞬时过表达编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因的可消耗的低温保存的细胞专利
本专利技术涉及低温保存的重组细胞，所述重组细胞瞬时过表达一种或多种编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因以使得所编码的蛋白的活性在从低温保存中解冻后的所述细胞群体中是可检测的。专利技术背景药物开发是昂贵且耗时的尝试，其中药物候选物在获得销售其的监管许可之前必须满足由政府部门例如美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局制定的一定标准。重要地，进行了测定来筛选药物候选物以确定是否某些是一种或多种药物转运蛋白和/或药物代谢酶的底物或抑制剂，因为其可对这样的药物的吸收、分布、代谢和消除、它们的毒性以及药物间相互作用具有显著的作用。虽然稳定表达编码药物转运蛋白或药物代谢酶的基因的细胞系可用于这样的筛选，但产生和维持其冷冻储备物需要大量的时间和资源。并且，所表达的重组蛋白的水平通常是可变的(实验室与实验室之间)并且可在这些细胞的传代下随时间过去而降低和/或变得更加可变。可选择地，可将稳定或瞬时表达编码药物转运蛋白或药物代谢酶的基因的、新鲜平板接种的细胞用于这样的筛选。然而，新鲜平板接种的细胞具有有限的几天的保存期限并且难以以维持其活力的方式进行运送。此外，为了产生稳定细胞系，外来转染的基因实际上被整合至细胞的宿主基因组中并与宿主基因组在细胞分裂周期期间保持在一起。宿主细胞中的染色体整合将导致宿主基因组的永久修饰，这潜在地导致其它基因的异常表达从而引起宿主行为的非期望的改变和不可靠的实验结果。因此，需要减少与药物开发相关的时间和资源投入并且提供可靠结果的、适合用于筛选药物候选物的细胞。专利技术概述本专利技术提供低温保存的重组细胞，其适合用于筛选药物候选物以确定是否某些是一种或多种药物转运蛋白和/或药物代谢酶的底物或抑制剂，其提供可靠的结果和现成的方便性。期望地，低温保存后的重组细胞群中的活性水平与新鲜转染的细胞的活性水平是相当的。此外，容易将低温保存的重组细胞装入小瓶中并利用干冰或干式运输(dryshipper)进行运送，且在接收后方便地储存在-135℃液氮中，具有数年的保存期限。因此，这样的细胞为最终用户提供了可消耗的“解冻和使用”产品，其提供进行实验的便利并减少产生和/或维持用于筛选药物候选物的细胞储备物的时间和资源的投入。在一个方面，本专利技术提供了包含一种或多种瞬时过表达基因的低温保存的重组细胞，所述基因编码选自药物转运蛋白和药物代谢酶或其组合的蛋白，其中所述药物转运蛋白或药物代谢酶或组合的活性在从低温保存中解冻后的所述低温保存的重组细胞群体中是可检测的。在另一个方面，本专利技术提供了制备瞬时转染的重组细胞的方法，所述重组细胞瞬时过表达一种或多种编码选自药物转运蛋白和药物代谢酶或其组合的蛋白的基因，所述方法包括用一种或多种编码药物转运蛋白或药物代谢酶的基因瞬时转染细胞和在转染的48小时内低温保存瞬时转染的重组细胞。本专利技术的这些和其它特征将通过研究下文的详细描述而被更好地理解。附图概述图1是针对悬浮生长的FreeStyleTM293-F(FS293)细胞和293-F细胞的来自细胞储备物、电穿孔(EP)后的细胞和从低温保存中解冻后的细胞的活细胞百分比图。图2是从低温保存中解冻后的平板接种之后4小时(A)、24小时(B)和48hrs(C)，转染的细胞的图像。图3是以(A)0.4x106个活细胞/孔和(B)0.2x106个活细胞/孔，平板接种于24孔聚-D-赖氨酸涂覆的平板中并在平板接种培养基中培养的、用pOATP1B1表达质粒转染的293-F细胞在平板接种(从低温保存中解冻后)后24小时的图像。图4是以0.4x106个活细胞/孔平板接种于24孔聚-D-赖氨酸涂覆的平板中的，用MATE1、MATE2KOATP1B3、长同种型OAT1(具有563个氨基酸的全长cDNA；在本文中被称作“长OAT1”)、短同种型OAT1(缺失C-末端522-534上的13个氨基酸，具有550个氨基酸；在本文中被称作“短OAT1”)、OAT3和pCMV载体转染的293-F细胞在平板接种(从低温保存中解冻后)后24小时的图像。图5是用50μg/ml、100μg/ml或200μg/ml绿色荧光蛋白(GFP)转染的贴壁HEK293细胞在EP后24小时(A)和48小时(B)的荧光图像。图6是使用不同量DNA对贴壁HEK293细胞进行EP后的活细胞百分比图。图7A是在EP后48小时，用不同量的DNA(即0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml或400μg/ml的OATP2/OATP1B1)转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二醇-17β-葡糖苷酸(E17βG)吸收活性的图。图7B是在EP后96小时，用不同量的DNA(即0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml或400μg/ml的OATP2/OATP1B1)转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二醇-17β-葡糖苷酸(E17βG)吸收活性的图。图8是在EP后48小时，用不同量的DNA(即0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml或400μg/ml的OATP2/OATP1B1)转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二醇-17β-葡糖苷酸(E17βG)吸收的信噪比图。图9是使用小规模EP设备(OC400)用OATP2/OATP1B1、使用大规模EP设备(CL2)用OATP2/OATP1B1或用空载体对照转染的贴壁HEK293细胞中，雌二醇-17β-葡糖苷酸(E17βG)吸收活性的图。图10是使用“对照”(即传统的脂质转染试剂(lipofectamine2000，可获自Invitrogen))或STX、MaxCyte可扩展EP设备用OATP1B1基因转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二醇-17β-葡糖苷酸(E17βG)吸收的信噪比的图。图11是用OATP1B1转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二醇-17β-葡糖苷酸(E17βG)吸收的信噪比的图，其中所述细胞是新鲜平板接种的或是从低温保存中解冻后平板接种的。图12是使用MaxCyte可扩展EP设备和按比例放大过程用OATP1B1*1a(基因登录号NM_006446.4)、OATP1B1*1b(基因登录号NM_006446.3)、OATP1B3、pCMV载体、长同种型OAT1(具有563个氨基酸的全长cDNA)、OAT3、OCT1或OCT2转染的HEK293细胞在低温保存、解冻、平板接种于聚-D-赖氨酸平板上和在平板接种后温育24小时后的图像。图13A是描述在用3μM浓度的PAH温育不同的时间(即1、2、5、10和15分钟)后，过表达OAT1或pCMV载体的HEK293细胞中p-氨基马尿酸盐(PAH)(OAT1的原型底物)吸收的时间依赖性测定的结果的图。图13B是描述其中测量在温育5分钟后，过表达OAT1的HEK293细胞对浓度为3至200μM的PAH的吸收的动力学测定的结果的图。使用Sigma-plot计算的Km和Vmax在图中显示为插注。图13C是描述其中使用15μM浓度的PAH和0-300μM浓度的丙磺舒(OAT1抑制剂)温育过表达OAT1的HEK293细胞5分钟的抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含一种或多种瞬时过表达基因的低温保存的重组细胞，所述基因编码药物转运蛋白，其中所述药物转运蛋白的活性在从低温保存中解冻后的所述低温保存的重组细胞的群体中是可检测的，所述低温保存的重组细胞被所述一种或多种基因瞬时转染，所述瞬时转染包括电穿孔，所述一种或多种基因是OAT3，所述细胞是HEK293。

【技术特征摘要】
2012.09.11 US 61/699,4661.包含一种或多种瞬时过表达基因的低温保存的重组细胞，所述基因编码药物转运蛋白，其中所述药物转运蛋白的活性在从低温保存中解冻后的所述低温保存的重组细胞的群体中是可检测的，所述低温保存的重组细胞被所述一种或多种基因瞬时转染，所述瞬时转染包括电穿孔，所述一种或多种基因是OAT3，所述细胞是HEK293。2.如权利要求1所述的重组细胞，其中所述一种或多种基因各自来源于人或选自小鼠、大鼠、豚鼠、狗和猴的动物物种。3.如权利要求1所述的重组细胞，其中所述药物转运蛋白的活性在从低温保存中解冻后平板接种之后至少24小时的所述细胞的群体中是可检测的。4.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，王洁，C·J·帕特恩，
申请(专利权)人：康宁有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US