一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种利用CRISPR‑Cpf1/sgRNA快速、简单、高效、特异性敲除T细胞免疫检测点通路基因的方法，有效解决了利用CRISPR‑Cas9系统对PD‑1、CTLA‑4、LAG‑3和TIM3基因敲除的缺陷。本发明专利技术的具体步骤包括：明确T细胞免疫检测点通路基因的目标DNA区域，根据选定的目标DNA区域，设计sgRNA引物对，并利用CRISPR‑Cpf1系统特异性定向敲除T细胞免疫检测点通路基因。本发明专利技术简单易行，免疫检查点敲除T细胞有效性更好，安全性更高。

【技术实现步骤摘要】
一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用
本专利技术属于基因工程
；具体涉及T淋巴细胞的改造；更具体的,涉及利用CRISPR-Cpf1系统制备阻断免疫检查点T细胞及制得的T细胞及其应用。技术背景恶性肿瘤发病率和死亡率高居不下，是威胁人类健康的头号杀手，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。近年来，随着基因工程技术的发展，对于免疫调节机制认识的加深，以及更多抗肿瘤免疫调节药物的实验数据支持，免疫检查点治疗药物已成为对抗肿瘤的新手段。免疫检查点阻断成为细胞免疫治疗的研究热点，也是当前靶向基因治疗最成功的的领域,免疫检查点控制共刺激和共抑制信号的平衡，而免疫检查点的平衡使T细胞的免疫效应保持适当的深度、广度，从而最大程度减少对于周围正常组织的损伤，维持对自身组织的耐受、避免自身免疫反应。然而，肿瘤细胞可异常上调共抑制分子及其相关配体，抑制T细胞的免疫活性，进而造成免疫逃逸。目前，针对肿瘤的免疫治疗研究的热点，且较为成熟的免疫检查点有：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(T-lymphocyteantigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受体-1(programmeddeath-1，PD-1)、淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyteactivationgene-3,LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3(T-cellimmunoglobulinandmucin-3)等。其中PD-1的主要功能是限制外周组织的效应T细胞活性，肿瘤细胞表达的PD-1配体和T细胞的PD-1结合，抑制体细胞激活相关激酶，从而抑制效应T细胞活性；CTLA-4主要表达在活化的T细胞或自然杀伤细胞中，当与抗原呈递细胞表面的B7-1(CD80)/B7-2(CD86)结合后，CTLA-4可以负向调节T细胞的活化，导致T细胞应答的下调；TIM-3是免疫调节分子TIM家族成员，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，高表达于Th1和细胞毒性T细胞(Tc1)上，与其配体半乳糖凝集素-9(Galectin-9)相互作用时，可导致Th1和Tc1的细胞凋亡；LAG-3属于免疫球蛋白超家族，主要表达于活化的T细胞和NK细胞表面，与MHC-Ⅱ亲和力高，当与配体结合后可抑制Th1细胞增殖和IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子的分泌，同时LAG-3同样能抑制CD8+T细胞活性，抑制细胞毒性作用。免疫检查点的阻断，则是指利用T细胞免疫检查抑制性受体的单克隆抗体，特异性阻断抑制性受体与其配体的结合，从而阻断免疫检查机制抑制T细胞活化的作用，增强效应T细胞的抗肿瘤效果。免疫检查点抑制剂治疗除CTLA-4、PD-1、PD-L1外，新的免疫检查点如LAG3、TIM-3、VISTA、A2aR、CD160等的研究也在不断的进行中，然而，当前临床上阻断性抗体也具有其不可避免的缺陷，如：抗体作用只是暂时阻断的作用；抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体还没有对策；不容易研发出有效的抗体；只针对细胞外靶点；抗体药物昂贵；抑制剂总体缓解率相对较低；长期应用免疫检查点抑制药可使免疫耐受性不平衡导致免疫检查点无检查点免疫反应等。为解决上述药物制剂的弊端，已有中国专利CN201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向PD-1基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术，达到特异性敲除PD-1基因的目的。再如中国专利CN201710991908.7公开了一种编码抗BCMA嵌合抗原受体的基因和包含有该基因重组表达载体，还公开了一种靶向骨髓瘤BCMA抗原的转基因T细胞，其制备方法：gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞，该专利技术在CAR-T构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除CAR-T细胞，并且敲除了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了CAR-T细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。虽然CRISPR-Cas9及其衍生技术被誉为人类改写生命代码的“神笔”，近年来为生物领域也带来了巨大的冲击，在2013年更被Science杂志评为十大科学突破之一，利用CRISPR-Cas9技术，科学家们能够高效、精确地对DNA序列进行修剪、替换或添加，可以快速地实现微生物基因组编辑、动植物的品种优化、动物模型构建，甚至推动疾病治疗的颠覆性革命。然而，随着研究的不断深入，CRISPR-Cas9也暴露了它的缺陷和局限性，如严重的脱靶效应，因此，科学家们也致力于寻找新的基因编辑系统，2015年麻省理工学院张峰小组报道了一种新的2类V型CRISPR效应蛋白Cpf1，是在单链向导RNA引导下与靶DNA特定位点结合并切割的核酸内切酶，而CRISPR-Cpf1的开发将有利于突破和克服CRISPR-Cas9应用中的一些限制，与CRISPR-Cas9相比CRISPR-Cpf1具有以下优势：Cpf1的分子量比Cas9小，更易进入细胞；Cas9和Cpf1均是单链RNA指导的核酸内切酶，但Cas9只具有DNA内切酶活性，而Cpf1同时具有DNA和RNA内切酶活性；CRISPR-Cas9初级转录产物pre-crRNA的成熟需要反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA与crRNA互补配对，在Cas9存在的条件下，由RNaseⅢ加工完成，而CRISPR-Cpf1的初级转录产物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的参与；CRISPR-Cas9将crRNA和tracrRNA融合成一条sgRNA(Single-guideRNA)，可以引导Cas9割DNA，其中sgRNA长度一般大于100nt，靶定不同的基因需要设计不同的sgRNA，而CRISPR-Cpf1中，Cpf1剪切DNA所需的crRNA长度仅为42-44nt，只需要替换CRISPR中的间隔序列就可以靶定不同基因，实现多个基因的同时编辑；Cas9识别位于靶序列的3′端的富含胞嘧啶(G)的PAM序列(5′-NGG-3′)，而Cpf1识别位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，Cpf1识别的PAM序列与Cas9不同，极大地扩宽了CRISPR系统基因组编辑的靶点范围，尤其是富含AT的基因组Cas9剪切位点离PAM序列很近，在其上游第3个核苷酸处进行切割，若发生NHEJ修复，造成的核苷酸插入或缺失会改变PAM临近序列，导致Cas9无法再次识别和切割靶位点从而阻碍同源重组修复在靶位点引入正确的基因编辑，而Cpf1的剪切位点离PAM序列较远，在靶DNA链的PAM序列下游第23位核苷酸和非靶DNA链的第18位核苷酸处进行切割，NHEJ修复造成的核苷酸插入或缺失，不会改变PAM临近序列，Cpf1仍然可以识别和切割靶基因，同源重组修复依然可以在靶位点引入正确的基因编辑；Cas9切割DNA形成一个平末端，而Cpf1切割DNA形成一个有5个核苷酸突出的黏性末端等。为了解决CRISPR-Cas9在用于T细胞改造中所显示出的缺陷和局限性，本专利技术提供一种更加精确特异性更强的针对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法，并提供相应的技术方案，达到特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)sgRNA寡核苷酸的设计和构建；(2)sgRNA的功能验证；(3)PBMC细胞的制备；(4)基因敲除T细胞的制备。

【技术特征摘要】
1.一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)sgRNA寡核苷酸的设计和构建；(2)sgRNA的功能验证；(3)PBMC细胞的制备；(4)基因敲除T细胞的制备。2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)sgRNA寡核苷酸的设计和构建，步骤为：1)明确T细胞免疫检测点通路基因目标DNA区域，选定具有Cpf1核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域为特异性靶序列；2)按照步骤1)选定的特异性靶序列，合成sgRNA引物对，引物对包含：具有5’-AGAT-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，退火形成双链DNA；3)对pGL3-U6-sgRNA质粒进行线性化；4)将步骤2)获得的双链DNA和3)获得的线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行连接，得连接产物；5)将步骤4)中所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞并涂平板，挑取克隆测序，测序结果正确的克隆即为含有sgRNA质粒的克隆。3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)sgRNA的功能验证，步骤为：1)细胞培养与转染，将HEK293T细胞接种于细胞培养板中，待细胞长到培养板的70-80％时，将步骤(1)得到的sgRNA质粒和sgCpf1质粒共转染至HEK293T细胞中，然后药杀48小时后收集细胞；2)T7EN1酶切检测，将步骤1)中收集的细胞进行DNA提取，并在sgRNA位点上下游设计引物F和引物R，并用引物F和引物R对所提取的DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物，然后对PCR扩增产物进行纯化回收，得PCR回收产物，取回收产物进行T7EN1酶切，然后进行电泳检测；3)T-A克隆测序，将T7EN1酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧莹，许先进，
申请(专利权)人：苏州茂行生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32