表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，包括如下步骤：序列选取；构建含嵌合抗原受体的pCDH载体；将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中；慢病毒的包装；表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备。本发明专利技术还提供了一种上述嵌合抗原受体T淋巴细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。本发明专利技术以肿瘤特异性抗原为靶点，并辅助表达CXCL10和CCL21分子，既可实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。

【技术实现步骤摘要】
表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造
，尤其涉及一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用。
技术介绍
2017年初，国家癌症中心发布了中国最新癌症数据，每一项数据都用客观的事实告诉我们：中国正在面临着一场抗癌战争。每天约1万人诊断癌症，每分钟约7人确诊患癌。目前，最常见的癌症治疗方法是化疗、放疗、肿瘤手术，以及前列腺癌和乳腺癌的激素治疗。然而，其他类型的治疗方法也开始起作用了：这些疗法本身或与其他疗法结合在一起，有助于更有效地战胜癌症，理想情况下，这些疗法的副作用也更少。癌症治疗的创新旨在解决一系列的问题，这些问题通常会面临医疗服务提供者和患者的问题，包括积极的治疗，伴随不良的副作用，治疗后的肿瘤复发，手术，或两者兼而有之，以及对广泛使用的治疗有弹性的侵袭性癌症。CAR-T，嵌合抗原受体T细胞，是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。CAR-T细胞在治疗血液癌症方面表现出非凡的功效，在实体肿瘤的治疗中，CAR-T细胞的浸润、积累和存活是清除肿瘤的关键，在这方面，CAR-T细胞免疫疗法可发展的空间还很大。EpCAM属于单次跨膜I型糖蛋白，EpCAM基因位于人染色体2p21，基因长度14kbp，相对分子量40kDa，其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成，其主要编码一种肿瘤相关抗原，多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。EpCAM参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。EpCAM的过表达导致Wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活，通过Wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclinA/E的表达，诱导细胞的增殖。多项研究证据表明，EpCAM在多种肿瘤组织中呈高水平表达，在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色，因此EpCAM成为前列腺癌免疫靶向治疗的重要靶点。人表皮生长因子受体2(HER2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测生物标志物，大约15–30％的乳腺癌和10–30％的胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过表达。HER2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部。HER2靶向治疗极大的改善了HER2阳性乳腺癌、胃/食管癌患者的预后。Glypican-3(GPC3)蛋白为硫酸肝素糖蛋白家族成员之一，CPC3相对分子质量约为66×103，它富含一段包括14个半胱氨酸残疾的独特序列，在N末端有一种分泌型信号蛋白，C端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上，且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由C端最末50个氨基酸决定，是该链靠近细胞膜。CPC3在在调控细胞生长和分化方面起重要作用，与肝癌的发生、发展密切相关，有报道称，肝癌组织中GPC3阳性率达到74.5％。所以GPC3在肝癌组织中特异性高表达的特性，可作为肝癌治疗的新靶点。CXCL10属于CXC趋化因子超家族的非ELR类,此类细胞因子能够趋化淋巴细胞或造血干细胞，抑制血管的生成。CXCL10又称干扰素诱导蛋白(IP10)，是在外源性和内源性炎性因子等刺激下，由成纤维细胞、内皮细胞、树突状细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌、表达的细胞因子。目前，越来越多的研究证明，CXCL10能够发挥抗肿瘤作用，其机制主要通过三种途径实现：CXCL10能够直接抑制肿瘤细胞的增殖，能趋化免疫效应细胞至肿瘤发生部位，能抑制肿瘤血管生成。CCL21是CC类趋化因子，又称为6Ckine或刺激淋巴组织趋化因子，是CCR7的配体之一，CCL21对某些人T细胞株和外周血淋巴细胞具有高效的化学驱动作用，但对单核细胞和中性粒细胞没有趋化作用，提示它对淋巴细胞具有特异性。CCL21主要通过诱导淋巴细胞和DC细胞增殖以及抑制肿瘤血管生成来发挥抗肿瘤作用。目前，CAR-T免疫治疗已在血液肿瘤中取得了卓著的成效，但在实体瘤的治疗中面临着肿瘤异质性与免疫抑制微环境的瓶颈，CAR-T细胞在实体瘤内浸润情况决定着CAR-T细胞的功效。因此，为了改变免疫抑制微环境，招募其他免疫效应细胞到达肿瘤位置，发挥联合抗肿瘤细胞，急需一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞，来实现分泌CXCL10和CCL21，从而使机体免疫细胞被招募至肿瘤部位进行杀伤肿瘤。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种能表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，包括如下步骤：(1)序列选取：选取CXCL10和CCL21作为目标序列；其中，CXCL10的DNA序列如SEQIDNO:1所示，CXCL10的DNA序列如SEQIDNO:2所示；(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；(3)将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：直接将CXCL10及CCL21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；(4)慢病毒的包装：先培养293T细胞，再使用Opti-MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；(5)表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备：在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2-4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)序列选取：选取CXCL10和CCL21作为目标序列；其中，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4‑1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；(3)将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：直接将CXCL10及CCL21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；(4)慢病毒的包装：先培养293T细胞，再使用Opti‑MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；(5)表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备：在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti‑body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2‑4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)序列选取：选取CXCL10和CCL21作为目标序列；其中，CXCL10的DNA序列如SEQIDNO:1所示，CXCL10的DNA序列如SEQIDNO:2所示；(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；(3)将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：直接将CXCL10及CCL21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；(4)慢病毒的包装：先培养293T细胞，再使用Opti-MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；(5)表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备：在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2-4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过NCBI官方网站上获取CXCL10和CCL21的DNA序列作为目标序列。3.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴斌，王维，刘振云，程丰伟，韩江萌，
申请(专利权)人：安徽古一生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34