表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR-T细胞的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR‑T细胞的构建方法及应用，涉及肿瘤免疫治疗技术领域，基于巨噬细胞会促进肿瘤恶化的问题而提出的。本发明专利技术包括一种携带CD40抗体的实体瘤特异性抗原靶点的CAR基因的慢病毒表达载体、表达CD40抗体的实体瘤特异性抗原靶点的CAR‑T细胞，本发明专利技术的有益效果在于：解决依赖TCR识别某种抗原的T细胞会大量增殖，并可能引起炎症等的不良反应，保证CAR‑T细胞能够特异性且专一地发挥肿瘤杀伤能力。

【技术实现步骤摘要】
表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR-T细胞的构建方法及应用
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗
，具体涉及一种表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR-T细胞的构建方法及应用。
技术介绍
2017初，国家癌症中心发布了中国最新癌症数据，每一项数据都用客观的事实告诉我们：中国正在面临着一场抗癌战争。每天约1万人诊断癌症，每分钟约7人确诊患癌。癌症新发人数继续上升，从358万增加到368万，增幅3％；世界新发病例约1409万，中国新发癌症病例占世界的1/4。我国癌症的治疗面临着巨大的挑战，目前传统的疗法主要有手术、化疗、放疗和靶向疗法，在一些癌症的治疗方面有一定的作用，但对于很多癌症的治疗效果非常局限。癌症的免疫疗法(CancerImmunotherapy)是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后出现的一种新型治疗方法，它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症，所有的癌症的发生从逻辑上都需要突破免疫系统的监视，而免疫疗法主要通过增强机体免疫系统功能，来消灭肿瘤细胞。免疫治疗经历了多年的不断发展，近几年取得了越来越多令人鼓舞的研究成果，包括针对免疫监控点分子或靶向抗原的单抗，双特异性抗体，肿瘤疫苗等。而在众多免疫疗法中，最受瞩目且具前景的当属嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它是免疫疗法与基因疗法相结合的创新疗法。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)即CAR-T技术是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(CD8、CD28)、胞内信号分子(CD3ξ)，共刺激因子(CD28、4-1BB、OX40)在体外进行基因重组，生成重组载体，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，也即CAR-T细胞，这些嵌合抗原受体修饰后的T细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，在肿瘤免疫应答中起主要作用。但是肿瘤细胞表面的MHC(主要组织相容性复合物)在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况，这样长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。此外，人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少，并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原，使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除，数量进一步减少。而CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力，这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合，而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径，从而克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，打破宿主的免疫耐受。所以，它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗的策略。从全球大量开展的CAR-T临床实验来看，CAR-T技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效，而在实体瘤方面，有一些令人鼓舞的突破，但还面临着诸多难点问题需要攻克。PSMA是存在于前列腺上皮细胞胞膜的一种Ⅱ型固有膜蛋白，其基因定位于11p11-12。PSMA含有750个氨基酸，分子量为100kD，在前列腺组织中高表达，卵巢和乳腺细胞膜上低表达，肠、肝、肾等细胞膜上几乎不表达。在前列腺癌中阳性率达到80.2％。因此PSMA成为前列腺癌免疫靶向治疗的重要靶点。由于实体瘤的复杂的微环境，CAR-T疗法在实体瘤的治疗中疗效并不明显。在实体瘤微环境中，存在这大量的巨噬细胞(TAM)的浸润。它们与肿瘤细胞，肿瘤干细胞，表皮细胞，成纤维细胞以及T/B细胞，NK细胞等存在高度的相互作用。虽然理论上讲巨噬细胞具有消灭肿瘤的能力，然而不断有实验证据表明TAM促进了肿瘤的恶化。在现在的放化疗过程中，在杀伤肿瘤细胞的同时不可避免的引发了组织损伤，机体会将这种肿瘤特异性的损伤误认为正常组织的受损，然后不可避免地启动由TAM主导的组织损伤修复机制。而这一效应的结果则是肿瘤会快速增长，并且患者会出现抗肿瘤放化疗的耐药性。EpCAM属于单词跨膜I型糖蛋白，EpCAM基因位于人染色体2p21，基因长度14kbp，相对分子量40kDa，其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成，其主要编码一种肿瘤相关抗原，多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。EpCAM参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。EpCAM的过表达导致Wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活，通过Wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclinA/E的表达，诱导细胞的增殖。多项研究证据表明，EpCAM在多种肿瘤组织中呈高水平表达，在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色，因此EpCAM成为前列腺癌免疫靶向治疗的重要靶点。人表皮生长因子受体-2(Her2)也称为c-erB2，由922个腺嘌呤、1382个胞嘧啶、1346个鸟嘌呤和880个胸腺嘧啶组成。人类该基因定位于染色体17q12，属于原癌基因。其编码产物HER2蛋白为185kD的跨膜精蛋白，简称p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区。HER2蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，属于EGFR家族成员之一，是迄今为止乳腺癌中研究较为透彻的基因之一。HER2癌基因的致瘤机制是抑制凋亡，促进增殖；增加肿瘤细胞的侵袭力；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。HER2基因的过表达不仅与肿瘤的发生发展相关外，还是一个重要的临床治疗监测及预后指标，并且是肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。CD40(Bp50)是与T细胞和B细胞功能有关的一种表面抗原，其前体含有297aa，为I型跨膜糖蛋白，由N端信号肽(20aa)、胞膜外区(193aa)、跨膜区(22aa)和胞浆区(62aa)组成。巨噬细胞中表达CD40，通过抑制性CD40抗体阻断巨噬细胞，从而达到抑制巨噬细胞促进肿瘤生长的功能。因此利用CAR-T疗法治疗实体瘤需要通过多方面的协同，才能发挥其抑制肿瘤的作用。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于巨噬细胞会促进肿瘤的恶化。本专利技术是采用以下技术方案解决上述技术问题的：一种表达CD40抗体的慢病毒载体，所述载体为携带实体瘤特异性抗原靶点的表达CD40抗体的慢病毒载体。优选的，所述载体为CAR基因的pCDH慢病毒载体。优选的，所述实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、EpCAM上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2HER2、白介素13受体α2IL13RA、癌胚抗原CEA、间皮素MSLN、成纤维细胞激活蛋白FAP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、卵泡刺激素受体FSHR、人前列腺特异性膜抗原PSMA、神经节苷脂GD2。本专利技术的还提供一种表达CD40抗体的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：(1)携带实体瘤特异性抗原靶点的CAR基因的慢病毒表达载体的构建；(2)携带CD40抗体的实体瘤特异性抗原靶点的CAR基因的慢病毒载体的包装。优选的，所述实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、EpCAM上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2HER2、白介素13受体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达CD40抗体的慢病毒载体，其特征在于：所述载体为携带实体瘤特异性抗原靶点的表达CD40抗体的慢病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种表达CD40抗体的慢病毒载体，其特征在于：所述载体为携带实体瘤特异性抗原靶点的表达CD40抗体的慢病毒载体。2.根据权利要求1所述的表达CD40抗体的慢病毒载体，其特征在于：所述载体为CAR基因的pCDH慢病毒载体。3.根据权利要求1所述的表达CD40抗体的慢病毒载体，其特征在于：所述实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、EpCAM上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2HER2、白介素13受体α2IL13RA、癌胚抗原CEA、间皮素MSLN、成纤维细胞激活蛋白FAP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、卵泡刺激素受体FSHR、人前列腺特异性膜抗原PSMA、神经节苷脂GD2。4.一种表达CD40抗体的慢病毒载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)携带实体瘤特异性抗原靶点的CAR基因的慢病毒表达载体的构建；(2)携带CD40抗体的实体瘤特异性抗原靶点的CAR基因的慢病毒载体的包装。5.根据权利要求4所述的表达CD40抗体的慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、EpCAM上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2HER2、白介素13受体α2IL13RA、癌胚抗原CEA、间皮素MSLN、成纤维细胞激活蛋白FAP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、卵泡刺激素受体FSH...

【专利技术属性】
技术研发人员：王维，韩江萌，刘振云，程丰伟，徐华栋，
申请(专利权)人：安徽古一生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34