一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体以及基于该载体的筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法。本发明专利技术通过将HTLV‑1病毒LTR区域序列片段克隆到双荧光素酶报告基因载体中，制成一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，可以用于检测CREB信号通路活性，也可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或者抑制剂。同时筛选到靶向调控CREB信号通路的岩藻多糖，岩藻多糖负调控抑制CREB通路激活。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法。
技术介绍
CREB(cAMPresponseelement-bindingprotein，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白)是一种细胞内转录因子，通过结合到环磷酸腺苷反应元件(cAMPresponseelement，CRE)上增强下游基因的表达。CREB信号通路调控着众多生命活动，包括组织发育、记忆形成、昼夜节律等等。CREB信号通路的活性异常将导致癌症、阿尔兹海默症等疾病的发生，并最终可能导致死亡。因此，灵敏可靠地检测CREB信号通路活性，以及人为调控CREB信号通路活性，对于科学研究和临床应用都具有巨大的价值。HTLV-1(HumanT-lymphotropicvirus1，人类T细胞白血病病毒Ⅰ型)是一种C型RNA逆转录病毒，导致全球1500-2000万人感染，从而引发成年人T细胞白血病(ATL)等疾病。HTLV-1基因组的LTR(longterminalrepeat，长末端重复)区域有三个CRE，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制。同时，HTLV-1基因组编码Tax蛋白能够激活宿主CREB信号通路以及NF-κB信号通路从而促进病毒自身存活和繁殖。因此，HTLV-1LTR区域是一个灵敏的CREB信号通路响应原件，而Tax蛋白是一个高效的CREB信号通路激活剂。多糖是一类由碳水化合物组成的高分子生物活性物质。除了直接提供能量，很多多糖因其独特的性质而具有显著的生理功能。已有的研究表面，多糖在增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂的方面都具有理想的功效。海藻多糖是一类藻类特有的碳水化合物，因其与众不同的结构而常常具有一些特殊的生理功能。我国海藻产量丰富，居全球首位，因此也拥有了丰富的海藻多糖资源。充分利用海藻多糖将能够产生巨大的经济和社会价值，发掘海藻多糖的新生理功能具有潜在的科学意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，通过筛选克隆得到一个HTLV-1病毒LTR区域序列片段，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制，将该LTR区域序列片段构建成一个双荧光素酶报告基因载体系统，可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或抑制剂。一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，包括萤火虫荧光素酶报告基因和HTLV-1病毒LTR区域序列片段，所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段位于萤火虫荧光素酶报告基因上游且被CREB蛋白激活后能够启动萤火虫荧光素酶报告基因表达。所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段的序列如SEQIDNo.1所示。该序列从HTLV-1病毒基因组中克隆获得，包含三个CRE，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制。所述的CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，序列如SEQIDNo.2所示。该序列包括pGL4.20[Luc2/Puro]质粒(Promega公司)的骨架，含有限制性内切酶BglII和HindIII酶切位点，通过酶切的方法将上述HTLV-1病毒LTR区域序列片段连接到pGL4.20[Luc2/Puro]质粒的BglII和HindIII之间，获得载体命名为pGL4.20-HTLV-1-LTR-2。本专利技术还提供了一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，包括以下步骤：(1)将所述CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体和内参载体、阳性对照载体同时转染细胞后培养，所述内参载体包含可持续稳定表达的海肾荧光素酶报告基因，所述阳性对照载体包含表达产物能够激活CREB信号通路的tax基因；(2)向细胞培养基中加入待筛选物质后继续培养；(3)检测各细胞组的荧光素酶活性，若加入待筛选物质的细胞组荧光素酶活性比未加待筛选物质的细胞组强，则该待筛选物质为CREB信号通路激动剂；若加入待筛选物质的细胞组荧光素酶活性比未加待筛选物质的细胞组弱，则该待筛选物质为CREB信号通路抑制剂。所述内参载体为pRL-CMV，序列如SEQIDNo.3所示。内参载体pRL-CMV购自Promega公司，包含有海肾荧光素酶报告基因，能够持续稳定地表达出海肾荧光素酶，用于作为内参消除误差。所述阳性对照载体为pcDNA3.1-Tax，序列如SEQIDNo.4所示。该阳性对照载体为将HTLV-1基因组中的tax基因插入pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1质粒购自Promega公司)获得，HTLV-1基因组中的tax基因编码的Tax蛋白能够激活宿主CREB信号通路从而促进病毒自身存活和繁殖，由于宿主细胞自身CREB信号通路激活水平较低，所以将所述CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体导入宿主细胞内后，萤火虫荧光素酶报告基因的表达水平非常有限，不容易检测，通过再导入tax基因表达Tax蛋白，可以激活宿主CREB信号通路，从而使萤火虫荧光素酶报告基因的表达水平得到大幅度提高，便于检测，减少检测误差。本专利技术还提供了岩藻多糖作为CREB信号通路抑制剂的应用。所述岩藻多糖的使用浓度为1μg/mL–1mg/mL。本专利技术利用上述方法筛选多种多糖，最后筛选得到岩藻多糖对CREB信号通路具有抑制作用，可以作为CREB信号通路的抑制剂。本专利技术通过将HTLV-1病毒LTR区域序列片段克隆到双荧光素酶报告基因载体中，制成一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，可以用于检测CREB信号通路活性，也可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或者抑制剂。同时筛选到靶向调控CREB信号通路的岩藻多糖，岩藻多糖负调控抑制CREB通路激活。附图说明图1为HTLV-1LTR区域片段PCR结果电泳检测图，其中，泳道1表示DNAMarkerDL2000(TaKaRa)，泳道2表示PCR产物，箭头所指表示目标片段HTLV-1基因组的LTR区。图2为pGL4.20载体的结构示意图。图3为载体pGL4.20-HTLV-1-LTR-2菌落PCR结果电泳检测图，其中，泳道1表示DNAMarkerDL2000(TaKaRa)，泳道2-7表示单菌落的菌落PCR鉴定结果，箭头表示正确的目标片段HTLV-1基因组的LTR区(2-5正确，6-7错误)。图4为岩藻多糖作为CREB信号通路抑制剂的筛选结果图。图5为岩藻多糖抑制CREB信号通路特异性验证结果图。具体实施方式实施例1根据GenBank中的HTLV-1的基因组序列(ID：9632565)中的LTR区采用PrimerPremier5.0软件设计PCR引物，扩增引物序列如下：上游引物FP1：5’-GCCAGATCTTGACAATGACCATGAGCCC-3’；下游引物RP1：5’-GGCAAGCTTCTCCTGAACTGTCTCCACGC-3’。上述引物由上海生工生物科技有限公司合成。目标片段DNA大小为353bp。首先，进行PCR扩增，使用C8166细胞基因组(使用天根生物细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取)作为PCR扩增模板，反应体系如下，体系总体积为50μL：反应程序为：98℃2min预变性；循环内98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；循环后72℃继续延伸3min；最后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，包括萤火虫荧光素酶报告基因和HTLV‑1病毒LTR区域序列片段，所述HTLV‑1病毒LTR区域序列片段位于萤火虫荧光素酶报告基因上游且被CREB蛋白激活后能够启动萤火虫荧光素酶报告基因表达。

【技术特征摘要】
1.一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，包括萤火虫荧光素酶报告基因和HTLV-1病毒LTR区域序列片段，所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段位于萤火虫荧光素酶报告基因上游且被CREB蛋白激活后能够启动萤火虫荧光素酶报告基因表达。2.如权利要求1所述的CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段的序列如SEQIDNo.1所示。3.如权利要求1所述的CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，序列如SEQIDNo.2所示。4.一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将如权利要求1～3任一所述CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体和内参载体、阳性对照载体同时转染细胞后培养，所述内参载体包含可持续稳定表达的海肾...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翀，王彦波，傅玲琳，周瑾茹，王飞飞，谢梦华，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33