The invention relates to the construction and identification of gene engineering carrier in the process of cancer cell therapy, and provides a method for identification of the fourth generation chimeric antigen receptor CAR vector PCR. When the fourth generation chimeric antigen receptor CAR plasmid positive colony is identified, two pairs of primers are amplified and sequenced and identified. . The advantage of the invention is that when the CAR plasmid positive colony is identified by PCR, the traditional \using one pair primer whole amplification sequencing identification\ is upgraded to \use two pairs of primers to amplify the sequence and identify\. This change will greatly improve the efficiency of PCR amplification, and also improve the accuracy of sequencing and prevent the detection of it. The results of false negative results were detected by the procedure.
【技术实现步骤摘要】
针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法
本专利技术涉及肿瘤细胞治疗技术研发过程的基因工程载体构建与鉴定领域,尤其涉及一种针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法。
技术介绍
癌症的免疫疗法(CancerImmunotherapy)是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后出现的一种新型治疗方法,它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症。免疫治疗经历了多年的不断发展,近几年取得了越来越多令人振奋的研究成果。而在众多免疫疗法中,最受瞩目且具前景的当属嵌合抗原受体T细胞免疫疗法,它是免疫疗法与基因疗法相结合的创新疗法。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T),即CAR-T技术,是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen,TAA,是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分,它们在正常细胞上有微量表达,但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(CD8、CD28)、胞内信号分子(CD3ξ),共刺激因子(CD28、4-1BB、OX40)在体外进行基因重组,生成重组载体,再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞,使患者T细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞,也即CAR-T细胞,这些嵌合抗原受体修饰后的T细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合,而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径,从而克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸 ...
【技术保护点】
1.一种针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法,其特征在于,对第四代嵌合抗原受体CAR质粒阳性菌落进行PCR鉴定时,使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定。
【技术特征摘要】
1.一种针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法,其特征在于,对第四代嵌合抗原受体CAR质粒阳性菌落进行PCR鉴定时,使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定。2.根据权利要求1所述的针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法,其特征在于,以慢病毒载体pCDH构建的第四代CAR质粒为对象,选用pCDH酶切位点前后两端序列以及CAR分子中CD3ζ中序列来设计两对引物,分别鉴定前段CAR分子以及后段细胞因子序列。3.根据权利要求2所述的针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法,其特征在于,所述两对引物具体如下:引物1:F1:accctgcttgctcaactctacgtcR1:gtggctgtactgagaccctggtaaagg;引物2:F2:ggagtacgatgttttggacaagagacgR2:cagcgtatccacatagcgtaaaagg。4.根据权利要求2所述的针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法,其特征在于,包括如下具体步骤:(1)设计两对引物以慢病毒载体pCDH构建的第四代CAR质粒为对象,选用pCDH酶切位点前后两端序列以及CAR分子中CD3ζ中序列来设计两对引物:引物1:F1:accctgcttgctcaactctacgtcR1:gtggctgtactgagaccctggtaaagg;引物2:F2:ggagtacgatgttttggacaagagacgR2:cagcgtatccacatagcgtaaaagg;(2)两套PCR反应体系的配置PCR反应体系1:10ulPrimistarhspremix2X,...
【专利技术属性】
技术研发人员:吴斌,王维,刘振云,徐华栋,程丰伟,
申请(专利权)人:安徽古一生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:安徽,34
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