限定的细胞培养表面及其使用方法技术

一方面，本发明专利技术提供了一种细胞培养基底，包括：一种具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中薄膜包含一种或多种的等离子聚合单体；以及在涂覆有薄膜的表面上的涂层，该涂层从包含一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液中沉积形成，其中，涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2009年7月27日、申请号为200910205733.8、专利技术名称为“限定的细胞培养表面及其使用方法”的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及用于培养细胞的限定的(defined)表面。特别是，本专利技术提供了对在限定的细胞培养表面培养胚胎干细胞和其他成体干细胞所需的材料和方法。
技术介绍
人类胚胎干细胞(hES)通常需要基底和培养基以保持无限期自我更新和多能性的特点。最常见的培养hES细胞的基底是生长在组织培养(TC)聚苯乙烯表面或涂覆有细胞外基质(ECM)的TC培养容器，例如：BD MatrigelTM涂覆的TC培养容器上的不活跃的成纤维细胞饲养细胞的单层。对这两种基底的限定都不佳，并且存在高度的实验变异性。由于人胚胎干细胞(hES)被认为在促进发育生物学知识、药物发现方面具有显著有效的影响，并且在今后的临床应用中可能发挥重要作用，因此鉴定这些细胞在限定的表面上的培养条件是非常重要的。专利技术概述一方面，本专利技术提供了一种细胞培养基底，包括：具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中所述薄膜包含一种或多种等离子聚合单体；以及在涂覆有薄膜的表面上的涂层，该涂层(coating)从包括一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液(coating solution)中沉积形成，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。在其他方面，本专利技术还提供了一种制备细胞培养基底的方法，包括：提供细胞培养表面；将薄膜等离子聚合到该表面上以形成涂覆有薄膜的表面，其中等离子聚合利用一种或多种单体；以及引入涂覆溶液到薄膜涂覆的表面以形成细胞培养基底，该涂覆溶液包括一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。在某些方面，本专利技术提供了一种培养干细胞的方法，包括：提供细胞培养基底；将干细胞的悬浮液应用至细胞培养基底；在37℃，含5％二氧化碳的潮湿空气条件中孵育在所述细胞培养基底上的干细胞；以及允许干细胞粘附在所述细胞培养基底上，其中粘附的细胞主要保持在未分化状态。除非在介质中使用特定的分化因子诱导分化(例如：实施例10)。更有利的一方面，本专利技术还可能提供了一种使干细胞具有良好的粘附特性、同时又有利于避免干细胞分化的细胞培养基底。附图简述图1：比较描述接种于各种基底上的结晶紫染色的人胚胎干细胞(hES)的细胞集落粘附情况：涂覆有细胞外基质，更具体地说，MatrigelTM，一种复杂的细胞外基质蛋白混合物(图1A)的组织培养(TC)处理的聚苯乙烯培养板，涂覆有人纤维连接蛋白TC处理的聚苯乙烯培养板(图1B)；和涂覆有人纤连蛋白(图1C)和生长介质的等离子聚合培养板。图2比较在选择的基底上的典型hES细胞的集落形态学：传代18代之后的，涂覆有细胞外基质(如，MatrigelTM)的TC培养板(图2A),和涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图2B)。图3未分化的hES细胞(H9系)的免疫细胞化学染色，其在核内表达OCT-3/4标志蛋白。细胞用生长介质培养,分别在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图3B)和涂覆有细胞外基质(如，MatrigelTM)的TC培养板(阳性对照，图3A)上培养。图4生长在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板和涂覆有细胞外基质(如，MatrigelTM)的TC培养板(阳性对照)上的未分化的hES细胞特异性标志蛋白的表达情况的定量荧光活化细胞分检器(FACS))分析。图5生长在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板和涂覆有细胞外基质(如：MatrigelTM)的TC培养板(阳性对照)上的hES细胞形成的胚状体中，种系特异性标志物基因的表达情况的定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)分析。图6在hES细胞来源的分化的细胞中，种系特异性标志蛋白的表达情况的免疫细胞化学染色分析。图7集中于层中的hFN的图像表示及示意图。图7A对涂覆有不同浓度的人纤连蛋白的等离子聚合培养板和TC培养板上结合的纤连蛋白含量的比较，并通过抗人纤连蛋白ELISA检测。图7B在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板上生长3天的hES细胞(H9系)的结晶紫染色。图8人间充质干细胞(MSC)在含血清的MSC介质中在组织培养培养板(图8A)上和在无血清的MSC介质中在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图8B)上的粘附情况和生长情况的比较。图9人间充质干细胞(MSC)分化成脂肪细胞的分化潜能的比较。将传代5代后的MSCs接种于未涂覆的组织培养培养板上(图9A)或接种于涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板上，并用脂肪形成介质诱导(图9B)。铺在组织培养板上的细胞之前用含血清的介质进行培养。铺在涂覆有纤连蛋白的等离子聚合培养板上的细胞之前在同样表面用不含血清的MSC介质进行培养。图10 hES细胞来源的神经元干细胞在组织培养板和等离子聚合培养板上的粘附情况和生长情况的比较。将细胞接种在未涂覆的组织培养培养板(图10a)，顺序涂覆有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的组织培养培养板(图10b)，未涂覆的等离子聚合培养板(图10c)和涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图10d)上。图11 hES细胞来源的神经元干细胞在组织培养培养板、涂覆有或未涂覆各种ECM蛋白的等离子聚合培养板上的粘附情况和生长情况的比较。图12该图表描述了MTS测定法检测hES细胞来源的神经元干细胞的生存能力。专利技术详述本专利技术提供了一种限定的细胞培养基底，该基底能够在更长的时间培养中，使得处于未分化状态的干细胞繁殖，并且维持其自我更新与多能性的特点。本专利技术的限定的培养表面与标准的培养基底例如组织培养处理的基底相比，能够促进处于未分化状态的人胚胎干细胞以及间充质干细胞和神经元干细胞更有效的粘附与扩展。在一些具体实施方案中，从所述限定的细胞培养表面上繁殖hES细胞、人骨髓来源的间充质干细胞和hES细胞来源的神经元干细胞。在一些具体实施方式中，所述限定的细胞培养表面无异物。本专利技术提供了一种细胞培养表面。优选的，该细胞培养表面限定在培养皿上。细胞培养表面可以限定在细胞培养容器或其他结构中的介质上。细胞培养表面的材料可以包括塑料(例如：聚苯乙烯，丙烯腈丁二烯苯乙烯，和聚碳酸脂)；玻璃；微孔过滤器(例如，纤维素，尼龙，玻璃纤维，聚酯，和聚碳酸酯)；在批量或连续细胞培养或者基因工程中作为生物反应器的材料(例如：生物反应器)，其中包括中空纤维管或微载体珠；聚四氟乙烯陶瓷和相关聚合材料。任何以上所列举的材料以及其他材料都适用于本专利技术。用于所述细胞培养表面的材料可能选自于：纤维素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、尼龙、玻璃、聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚甲基戊烷，聚丙烯，聚乙烯及其组合。这些材料均为多孔的或非多孔的。为了说明本专利技术，细胞培养或培养容器都应纳入本文参考。可以理解，本专利技术可以应用于各种细胞培养表面，包括但不限于存在于细胞培养容器中的介质上限定的表面，如微珠，微孔过滤器或其他过滤或者结合介质。优选的，所述细胞培养表面是由聚苯乙烯形成的。可以预计任何用于粘附培养的培养容器都可以使用。本专利技术预计的优选的细胞培养容器配置包括多孔培养板(例如：6孔、12孔和24孔培养板)，培养皿(例如：有盖培养皿)，实验试管，培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养基底，包含：具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中所述薄膜包含一种或多种等离子聚合单体；以及在所述涂覆有薄膜的表面上的涂层，所述涂层从包含一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液中沉积形成，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。

【技术特征摘要】
2008.07.25 US 61/083,570;2008.08.13 US 61/085,044;1.一种细胞培养基底，包含：具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中所述薄膜包含一种或多种等离子聚合单体；以及在所述涂覆有薄膜的表面上的涂层，所述涂层从包含一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液中沉积形成，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。2.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述一种或多种单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、醋酸、乙烯基醋酸以及它们的组合。3.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述一种或多种单体选自烯丙胺、甲胺、丙胺、庚胺和丙二胺。4.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述单体选自烷烃、烯烃、二烯、苯乙烯以及它们的组合。5.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述一种或多种单体选自胺、碳氢化合物以及它们的组合，其中胺与碳氢化合物的比例在约100:0到约20:80之间。6.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物中总蛋白的浓度为约1μg/mL到约300μg/mL。7.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物中总蛋白的浓度为约5μg/mL到约200μg/mL。8.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物包含细胞外基质蛋白，所述细胞外基质蛋白选自天然的、重组的、合成的细胞外基质蛋白及它们的组合。9.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物包含完整的细胞外基质蛋白或细胞外基质蛋白的片段。10.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物进一步包含选自巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、生长因子以及它们的组合的组分。11.权利要求1所述的细胞培养基底，其中水性溶剂选自缓冲液、细胞培养介质以...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·圣雅尔，D·萨克斯纳，S·X·钱，E·阿布拉哈姆，
申请(专利权)人：康宁有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US