本发明专利技术公开了一种共表达IL18的CD19特异性嵌合抗原受体T细胞的制备方法。本发明专利技术通过将含有CD19 CAR和IL18的睡美人质粒转座系统转染入T细胞中，同时加入特定剂量的IL2和anti‑CD3/CD28磁珠抗体，从而获得共表达IL18的CD19 CAR‑T细胞。所得的T细胞能够特异性地杀伤肿瘤细胞，同时表达的IL18能够显著增加T细胞的杀伤效果。
【技术实现步骤摘要】
一种非病毒载体共表达IL18的CAR-T细胞构建及其应用
本专利技术涉及免疫细胞制备领域，具体地，本专利技术涉及一种IL-18共表达于CD19特异性嵌合抗原受体T细胞及其用途。技术背景嵌合抗原受体T细胞治疗(ChimericantigenreceptorTcelltherapy,CAR-Ttherapy)是一种新兴的肿瘤免疫治疗，该疗法是通过对患者体内的T细胞进行改造，在T细胞膜上表达一种肿瘤特异性的嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptors,CARs)，使其能够通过肿瘤特异性的、非MHC分子依赖性的途径激活，从而发挥抗肿瘤作用。CAR是一种跨膜受体，主要由胞外识别结构域、跨膜区和胞内激活结构域组成，其胞外识别结构域通常为肿瘤细胞特征性表面分子的单链抗体(single-chainvariablefragment,scFv)，胞内激活结构域为T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)的CD3ζ，当CAR胞外的单链抗体与肿瘤细胞识别、结合，即可激活CD3ζC，进而直接激活T细胞。至今已发展出三代CAR，其中第二代CAR是研究最多、最具应用前景，第二代CAR分子在跨膜区和激活结构域之间还偶联了一个T细胞共刺激分子，如CD28、4-1BB等，在共刺激分子的协同作用下，CAR-T细胞表现出更持久的增殖能为和更强的抗肿瘤功能。近年来，改造CAR-T细胞使其表达某些细胞因子，可对CD8+T细胞的功能、生存和分化有促进作用，这些因子包括IL-12、IL-15、IL-7和IL21等，如在CAR分子上偶联某种细胞因子如IL-15，使细胞因子与CAR共表达于T细胞，也能显著提高T细胞的体内、体外生存和杀伤靶细胞的能力。与外源性细胞因子相比，CAR-T细胞共表达的细胞因子只作用于肿瘤局部微环境，无血液稀释的影响，并且不会对正常组织带来副作用。细胞因子IL18是一种具有抗肿瘤活性的蛋白质，IL-18可作用于T、B以及NK细胞等效应细胞的增殖与分化，促进IFN-γ的表达和克里梅的释放，从而发挥其抗肿瘤功能。IL-18和IL12也可直接作用于CD8+T细胞和NK细胞，诱导其产生更多的IFN-γ、释放颗粒酶B、表达FasL，从而进一步杀伤肿瘤细胞。同时，IL18因其相对低毒的特性以及和传统疗法的的协同作用引人注目。目前，将细胞整合进T细胞的方式包括病毒载体和非病毒载体两种方式。其中病毒载体虽然可以较高的拷贝数整合入宿主细胞基因组，但病毒载体的制备具有一定难度，特别是大规模制备；且慢病毒也有安全性的潜在风险。睡美人转座子(SleepingBeaut,SB)作为表达非病毒载体结构简单，操作容易，能插入大片段核酸序列，并且成本相较慢病毒很低。有研究表明，SB介导的基因修饰T细胞能在体外扩增2,200至2,500倍，CAR表达率可达84％，未发现有整合热点存在，说明SB转座子/转座酶系统极具CAR-T细胞的临床应用潜力。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，通过将含有CD19CAR和IL18的睡美人质粒转座系统转染入T细胞中，同时加入特定剂量的IL2和anti-CD3/CD28磁珠抗体，从而获得共表达IL18的CD19CAR-T细胞，并证明其在实体瘤治疗中的潜在应用。具体的说，本专利技术提供一种共表达IL18的CD19CAR-T细胞的构建方法，并赋予T细胞杀伤带有CD19靶点肿瘤细胞的能力。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案是：本专利技术的第一个目的是构建共表达IL18和CD19的嵌合抗原受体分子IL18CD19CAR，其包括信号肽、抗原结合区、铰链区、跨膜区、共剌激信号传导区、CD3ζ信号传导区、T2A短肽和IL18表达区。为了进一步优化上述CD19特异性嵌合抗原受体，所述抗CD19scFv抗体序列来源于本领域己公开的FMC63，该单克隆抗体氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。进一步地，所述较链区为CD8hinge区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，所述跨膜区所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQIDN0.5所示。进一步地，所述胞内共刺激信号传导区为CD28和4-1BB，其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。进一步地，所述胞内信号区为T细胞信号传导激活区域CD3ζ，其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。进一步地，所述胞内细胞因子共表达信号为IL18，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。更进一步地，基于以上CD19CAR分子的结构，本专利技术所述的该嵌合抗原受体为CMV-CSF2RA-CD19scFv-CD8α-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-IL18(RZ-FMC63-28bbZ-IL18)，其结构如图1所示，其核苷酸和氨基酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供一种共表达IL18的CD19CAR的转座子重组质粒/转座酶系统。进一步地，所述重组表达载体为原始重组表达载体为睡美人转座子载体pT/SVNeo(以下简写为pT/S)，其图谱见图2。通过限制性内切酶BglII/NotI双酶切后，与含有BglII/NotI双酶切位点的CD19CAR-IL18的核酸片段通过DNAT4连接酶构建为重组转座子质粒pT/SVNeo-CMV-CD19CAR-IL18。进一步的，将重组转座酶质粒SB11与重组转座子质粒pT/SVNeo-CMV-CD19CAR-IL18按照质量比1:3的比例混合，从而得到共表达IL18的CD19CAR的转座子重组质粒/转座酶系统。本专利技术的第三个目的是提供一种含有共表达IL18和CD19特异性嵌合抗原受体的核酸重组表达载体的宿主细胞。进一步地，所述宿主细胞为T细胞或含有T细胞的细胞群。进一步的，将pT-CMV-CD19CAR-IL18转座子及辅助转座酶SB11与PEIpro阳离子聚合物按照质量比1:4转染T细胞，可获得CD19CAR-IL18阳性的CD19CAR-T细胞。本专利技术还涉及一种上述宿主细胞的构建方法，其包括重组表达载体的构建步骤以及将重组表达载体转导至宿主细胞的步骤。最后，本专利技术还提供一种上述共表达IL18和CD19特异性嵌合抗原受体，上述编码CD19特异性嵌合抗原受体的核酸，上述重组表达载体以及宿主细胞在哺乳动物肿瘤治疗中的应用。进一步地，哺乳动物实体肿瘤包括但不限于，血液瘤、卵巢癌肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、神经母细胞瘤等。更具体的说，上述应用为一种共表达IL18和CD19的CAR-T细胞，其通过SB转座子/转座酶系统电转染T细胞，从而赋予了T细胞表达IL18和识别CD19分子的能力，并靶向CD19阳性的哺乳动物实体肿瘤。附图说明图1为共表达IL18的CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)分子结构的说明示意图：图2为转座子载体pT/SVNeo结构的说明示意图：图3为流式细胞检测CAR分子在T细胞中的表达率；图4为IL18基因在T细胞的表达情况；图5为T细胞、CD19CAR-T细胞和IL18CD19CAR-T细胞和靶细胞作用后的细胞亚群变化情况；图6为T细胞、CD19CAR-T细胞和IL18CD19CAR-T细胞和靶细胞Daudi的杀伤作用。具体实施本专利技术提供一种含有CD19CAR和IL18的睡美人本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种共表达IL18的CD19特异性嵌合抗原受体T细胞的制备方法，通过将含有CD19 CAR和IL18的睡美人质粒转座系统电转入T细胞中，从而获得共表达IL18的CD19 CAR‑T细胞。
【技术特征摘要】
1.一种共表达IL18的CD19特异性嵌合抗原受体T细胞的制备方法，通过将含有CD19CAR和IL18的睡美人质粒转座系统电转入T细胞中，从而获得共表达IL18的CD19CAR-T细胞。2.根据权利要求1所述的睡美人质粒转座系统，其特征在于，其系统包含有CD19CAR和IL的睡美人质粒pT/SVNeo和SB11质粒，其特征在于：(1)利用BglII和NotI酶切位点将CMV-CD19CAR-IL18构建入pT/SVNeo质粒中形成重组载体pT-CMV-CD19CAR-IL18；(2)利用PEIpro阳离子聚合物转染试剂转染pT/SVNeo-CM...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈相波，冯煜，雷鸣，田朋飞，
申请(专利权)人：杭州荣泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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