一种Tc1iPs细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种Tc1iPs细胞系及其构建方法。所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。本发明专利技术建立的Tc1iPS细胞系，作为一种细胞模型，将有助于研究发育早期唐氏综合征的发生发展机制，以及在细胞水平进行相关治疗性研究，以推动胚胎早期唐氏综合症的干预性防治。

A Tc1iPs Cell Line and Its Construction Method

The invention discloses a Tc1iPs cell line and a construction method thereof. The cell line is a cell line prepared by Yamanaka four-factor reprogramming method from tail tip skin fibroblasts of mice with Down syndrome. The Tc1iPS cell line established by the present invention, as a cell model, will be helpful to study the mechanism of Down's syndrome occurrence and development at the early stage of development, as well as to carry out relevant therapeutic research at the cell level, so as to promote the interventional prevention and treatment of Down's syndrome at the early stage of embryo.

【技术实现步骤摘要】
一种Tc1iPs细胞系及其构建方法
本专利技术属于诱导性多能干细胞
，具体涉及一种Tc1iPs细胞系及其构建方法。
技术介绍
唐氏综合征患儿在出生时即已有明显的特殊面容，且常呈现嗜睡和喂养困难，其智能低下表现随年龄增长而逐渐明显，智商约25-50，动作发育和性发育都延迟，患儿眼距宽，鼻根低平，眼裂小，眼外侧上斜，有内眦赘皮，外耳小，舌胖，常伸出口外，流涎多，身材矮小，头围小于正常，头前，后径短，枕部平呈扁头，颈短，皮肤宽松，骨龄常落后于年龄，出牙延迟且常错位，头发细软而较少，发旋多居中，前囟闭合晚，顶枕中线可有第三囟门，四肢短，由于韧带松弛，关节可过度弯曲，手指粗短，小指中节骨发育不良使小指向内弯曲，指骨短，手掌三叉点向远端移位，常见通贯掌纹，草鞋足，拇趾球部约半数患儿呈弓型皮纹。患儿常伴有先天性心脏病等其他畸形，因免疫功能低下，易患各种感染，白血病的发生率比一般增高10-30倍，如存活至成人期，则常在30岁以后即出现老年性痴呆症状。唐氏综合征致病原因是由于多了一条21号染色体，但致病机理和疾病的发生衍变并不十分清楚。iPS细胞可作为一种工具疾病细胞模型，用于研究疾病的病理学发生机制及用来进行治疗性研究。目前，尚没有一种可用于方便的研究唐氏综合征的iPS细胞系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Tc1iPs细胞系及其构建方法。一种Tc1iPs细胞系，所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。上述Tc1iPs细胞系的制备方法，按照如下步骤进行：(1)制备Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞；(2)制备KMSO质粒，并复苏和培养PlatE细胞；(3)Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒包装；(4)以小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，将KMSO质粒转染入Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞中。所述Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的制备方法如下：(1)剪取Tc1小鼠0.5-1.5cm尾尖，浸泡于2％Pen/Step的PBS中；(2)用手术刀刮去毛发后用眼科剪将其剪成组织块，将真皮层贴于直径是3.5cm的培养皿中，并用盖玻片轻压；(3)滴加少许15％FBS的FP培养液，过夜后加入2mlFP培养液；(4)每2天更换新鲜FP培养液，第8-12天用0.25％的胰酶消化后按1:3进行传代培养；(5)等细胞长至95-100％汇合度时，用成纤维细胞冻存液冻存。所述小鼠胚胎成纤维细胞的制备方法如下：(1)颈椎脱臼处死怀孕13.5天的ICR孕鼠，75％酒精消毒小鼠，剖腹取子宫置于含2％P/S的PBS中；(2)解剖显微镜下，将小鼠胚胎一个个分离出来，去头、去四肢、去尾、去内脏；(3)将小鼠胚胎皮肤置于1.5mlEP管中，用眼科剪将其彻底剪碎；(4)将组织转移到50ml离心管中，加入5-10ml0.25％胰酶，用5ml吸管反复吹吸，将组织块消化成单细胞，用10％FP培养液中止消化；(5)1,000rpm/min离心3分钟后，用用10％FP培养液重悬细胞，按8×106cells量接种于75cm2培养瓶中，第二天换液；(6)待细胞长至100％汇合度后，消化传代，按1：3接种；(7)细胞长至100％汇合度后，一个75cm2培养瓶细胞量冻存一管冻存细胞。所述滋养层细胞的制备方法如下：(1)小鼠胚胎成纤维细胞长至90％左右时，用浓度10ug/ml的丝裂酶素处理；(2)丝裂酶素处理2-3小时，用无钙镁PBS洗四遍，0.25％Trypsin-EDTA消化2分钟，用2倍体积10％FP培养基终止消化；(3)1000rpm/min离心3分钟后用10％FP培养基重悬，接种于预先用0.2％Gelatin处理过的10cm培养皿中，细胞密度控制在85％左右。本专利技术的有益效果：本专利技术用Yamanaka四因子重编程方法将唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成Tc1iPSCs，并建立细胞系，同时制备嵌合体小鼠以验证其多潜能分化能力，通过高通量基因组甲基化谱分析，与具有四倍体补偿的iPS细胞系比较，Tc1iPSCs总体甲基水平较高，这表明唐氏综合征的发生机制可能和胚胎发育早期的表观遗传学改变有关系。本专利技术建立的Tc1iPS细胞系，作为一种细胞模型，将有助于研究发育早期唐氏综合征的发生发展机制，以及在细胞水平进行相关治疗性研究，以推动胚胎早期唐氏综合症的早期干预性防治。附图说明图1为Tc1-iPS细胞系形态学电镜图；图中，R1-ES：正常小鼠ESCs；14D-1-iPSCs：具有四倍体补偿能力的小鼠iPSCs；Tc1-iPSCs：小鼠21三体iPSCs。图2为Tc1-iPS基因型鉴定图；图中，M：Marker；21TG：Tc1iPSCs；14D-1：小鼠14D-1iPSCs；R1：小鼠R1ESCs；Blank：空白对照。图3为Tc1-iPS嵌合体小鼠形态图。图4为Tc1-iPS甲基化谱检测分析图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1小鼠：Tc1小鼠，其尾尖皮肤成纤维细胞用于制备iPSCs。ICR小鼠，其E3.5囊胚用于制备嵌合体小鼠，以及用于囊胚移植受体小鼠。Tc1小鼠iPS细胞系的制备，参照YamanakaKlf4、c-Myc、Sox2、Oct4四因子重编程方法。(一)Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的制备。1.剪取Tc1小鼠1cm的尾尖，浸泡于2％Pen/Step的PBS中。2.用手术刀刮去毛发后用眼科剪将其剪成组织块，将真皮层贴于直径是3.5cm的培养皿中，并用盖玻片轻压。3.滴加少许15％FBS的FP培养液，过夜后加入2mlFP培养液。4.每2天更换新鲜FP培养液，第10天用0.25％的胰酶消化后按1:3进行传代培养。5.等细胞长至95-100％汇合度时，用成纤维细胞冻存液冻存。(二)小鼠胚胎成纤维细胞(Mouseembryofibroblasts，MEF)的制备和培养1.颈椎脱臼处死怀孕13.5天的ICR孕鼠，75％酒精消毒小鼠，剖腹取子宫置于含2％P/S的PBS中。2.解剖显微镜下，将小鼠胚胎一个个分离出来，去头、去四肢、去尾、去内脏。3.将小鼠胚胎皮肤置于1.5mlEP管中，用眼科剪将其彻底剪碎。4.将组织转移到50ml离心管中，加入5-10ml0.25％胰酶，用5ml吸管反复吹吸，将组织块消化成单细胞，用10％FP培养液中止消化。6.1,000rpm/min离心3分钟后，用用10％FP培养液重悬细胞，按8×106cells量接种于75cm2培养瓶中，第二天换液。7.待细胞长至100％汇合度后，消化传代，按1：3接种。8.细胞长至100％汇合度后，一个75cm2培养瓶细胞量冻存一管冻存细胞。(三)KMSO质粒制备KMSO质粒：pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-cMyc。质粒转化：(1)四份100ulDH5α感受态细胞分装于预冷的离心管中，置于冰浴中。(2)分别加入pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-Nanog、pMXs-Nanog质粒1ul(100ul感受态细胞可被1ng超螺旋DNA饱和，轻旋离心管以混合内容物，冰浴中静置30分钟)。(3)离心管中置于42℃水浴中60-90秒后快速将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Tc1iPs细胞系，其特征在于，所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种Tc1iPs细胞系，其特征在于，所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。2.权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)制备Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞；(2)制备KMSO质粒，并复苏和培养PlatE细胞；(3)Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒包装；(4)以小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，将KMSO质粒转染入Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞中。3.根据权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，所述Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的制备方法如下：(1)剪取Tc1小鼠0.5-1.5cm尾尖，浸泡于2％Pen/Step的PBS中；(2)用手术刀刮去毛发后用眼科剪将其剪成组织块，将真皮层贴于直径是3.5cm的培养皿中，并用盖玻片轻压；(3)滴加少许15％FBS的FP培养液，过夜后加入2mlFP培养液；(4)每2天更换新鲜FP培养液，第8-12天用0.25％的胰酶消化后按1:3进行传代培养；(5)等细胞长至95-100％汇合度时，用成纤维细胞冻存液冻存。4.根据权利要求1所述Tc1iPs细胞系的制备方法，其特征在于，所述小鼠胚胎成纤维细胞的制备方法如下：(1)颈椎脱臼处死怀孕13.5天的ICR孕鼠，75％酒精消毒小鼠，剖腹取子宫置于含2％P/S的PBS中；(2)解剖显微镜下，将小鼠胚胎一个个分离出来，去头、去四肢、去尾、去内脏；(3)将小鼠胚胎皮肤置于1.5mlEP管中，用眼...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡一，黄淑帧，杨冠恒，曾溢滔，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，上海滔华生物医药科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：上海,31