一种干细胞外泌体、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种干细胞外泌体、制备方法及应用，首先对用户肌肤问题进行关于皮肤的基因检测，根据基因检测的结果，寻找到改善其肌肤问题的目的基因，通过体外合成手段对所述目的基因进行扩增，然后将目的基因转至载体制备成靶基因载体，将所述靶基因载体转染进间充质干细胞得到靶基因间充质干细胞，最后将所述靶基因间充质干细胞进行培养，收集其细胞培养液，提取所述细胞培养液中的外泌体，将提取好的外泌体进行灭菌、定量后分装保存；与现有技术相比，本发明专利技术的有益效果在于从基因根源入手，修复问题基因从而有效改善肌肤问题，缓解“内部老化”。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞外泌体、制备方法及应用
本专利技术涉及干细胞领域，具体涉及一种干细胞外泌体、制备方法及应用。
技术介绍
MSC是目前研究最多的干细胞，目前许多临床试验以证实MSC能够治疗多种疾病，并且具有较好效果，同时MSC具有更强的安全性，且在不同酸碱环境、缺氧、高温、反复冻融等恶劣条件下仍能保持较高稳定性，用其制成的功能性美容产品能够最大限度的保持细胞再生因子的活性和功能，现今干细胞外泌体护肤产品的研究已有很多，大都是利用其外泌体的活性使肌肤状况改善。然而，肌肤问题多种多样，用户需求也多种多样，抗衰、美白、抗敏等等，但是造成肌肤问题的原因则是由许多因素，例如阳光暴露、空气污染、吸烟、酗酒、营养不良、不健康饮食、慢性疾病等环境性因素，另一种则是有我们自身的遗传基因调控，无论是衰老、黑色素沉积还是过敏性肌肤，与相关基因的表达活性有很大关系。现今护肤品大都是从防护着手，改善或修复外部环境带来的损伤，无法从根源解决基因问题带来的肌肤问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种干细胞外泌体、制备方法及应用。具体技术方案如下：一种干细胞外泌体，其不同之处在于，所述干细胞外泌体由含有改善皮肤的靶基因载体的间充质干细胞分泌，所述靶基因载体包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一种或多种基因。一种制备上述干细胞外泌体方法，其不同之处在于，首先对用户肌肤问题进行关于皮肤的基因检测，根据基因检测的结果，寻找到改善其肌肤问题的目的基因，通过体外合成手段对所述目的基因进行扩增，然后将目的基因转至载体制备成靶基因载体，将所述靶基因载体转染进间充质干细胞得到靶基因间充质干细胞，最后将所述靶基因间充质干细胞进行培养，收集其细胞培养液，提取所述细胞培养液中的外泌体，将提取好的外泌体进行灭菌、定量后分装保存；所述测试的基因如下中的一种或多种基因组合：与青春痘形成的相关基因组合：EDAR、CYP21A2、KIF3A、OVOL1、ATP2A2；皮肤防晒能力的相关基因组合：MC1R、OCA2、SOD1、CYP21A2、KIF3A、OVOL1；皮肤抗敏性的相关基因组合：COL5A1、MC1R、KIF3A、OVOL1、SOD1；与雀斑黑色素形成相关的基因组合：MC1R、OCA2、BNC2、TYR；抗皱能力的相关的基因组合：SOD1、GHRHR、EDAR、FLG、MC1R、MMP9；与皮肤防辐射能力及抗衰老能力相关的基因组合：XRCC1、RAD51、HBE1、MMP9、SOD1、CHRHR、KL。上述技术方案中，所述目的基因包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一种或多种。上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法包括以下步骤：(1)将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；(2)将所述目的基因进行扩增，并加入酶切位点，装入载体，得到靶基因载体，将所述靶基因载体转至步骤(1)所述间充质干细胞，得到靶基因间充质干细胞；(3)将步骤(2)中选取的间充质干细胞使用ɑ-MEM空培养基进行培养，培养一段时间后，去除杂质，分离出培养上清液；(4)将步骤(3)所述培养上清液与TotalexosomeIsolation外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；(5)将步骤(4)所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入TotalexosomeIsolation外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得间充质干细胞分泌的外泌体。上述技术方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞中的一种。上述技术方案中，所述载体为质粒，所述靶基因载体转染方法为lipo2000转染法或电转法。上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法步骤(3)通过以下步骤完成：步骤3A:将不含外泌体血清的空白干细胞ɑ-MEM培养基加入步骤(2)所述筛选的靶基因间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基；3B：将步骤3A中所述条件培养基在4℃，2000g条件下离心30min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，即培养上清液。上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法步骤(4)通过以下步骤完成：步骤4A：将步骤3B中所述培养上清液与TotalexosomeIsolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育过夜，孵育后得到第一孵育液；步骤4B：将步骤4A所得第一孵育液在4℃，10000g条件下离心60min,所得肉眼不可见的底部沉淀，即为含外泌体的浓缩液。上述技术方案中，所述干细胞外泌体制备方法步骤(5)通过以下步骤完成：5A：将步骤4B中所述含外泌体的浓缩液用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行溶解，得到外泌体盐溶液；5B:在步骤5A所述外泌体盐溶液中加入外泌体提取液，在4℃条件下孵育1小时至12小时,所述外泌体盐溶液与TotalexosomeIsolation外泌体提取液的体积比为2:1，孵育后得到第二孵育液；5C：将步骤5B中所述第二孵育液在4℃，10000g条件下离心60min，所得下层肉眼不可见的沉淀即为间充质干细胞分泌的外泌体。上述干细胞外泌体在护肤上的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于从基因根源入手，修复问题基因从而有效改善肌肤问题，缓解“内部老化”，根据不同用户的肌肤问题进行精准护肤，从而达到更好的护肤效果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例一用户A：女，25岁，敏感性肌肤，常年出现红血丝，皮肤瘙痒的问题，首先利用基因测试对下列基因进行测试：皮肤抗敏性的相关基因：COL5A1、MC1R、KIF3A、OVOL1、SOD1；测试结果显示：用户ACOL5A1基因表达活性偏低导致皮肤厚度偏薄，同时KIF3A、OVOL1基因表达活性偏高导致皮肤过敏反应相较于常人严重。目的基因筛选：COL5A1、KIF3A、OVOL1及SOD1，旨在增加皮肤厚度，增加皮肤光抗敏性和黑色素降解能力，进而提高皮肤的抵抗性。按下列步骤制备针对用户A的干细胞外泌体：间充质干细胞分离培养1)用无菌瓶(200ml生理盐水+一支庆大霉素)取回新鲜脐带；2)分离血管周围的沃顿胶(Wharton’sjelly)，剪碎；3)放入2mg/mlⅠ型胶原酶中(约15ml)；4)加入200μl的双抗和200μl的两性霉素B，混合均匀后置于培养箱中(37℃)过夜；5)约20ml/皿)，每皿加1ml添加剂，200μl的双抗和200μl的两性霉素B,置培养箱中培养；6)根据培养状态适时适量换液，待细胞长满后传代培养。间充质干细胞传代1)细胞长满后(约1×107)进行传代培养至3～5代。2)吸取皿中部分培养基至50ml离心管(3ml/皿)，剩余转至废液缸；3)每皿加8ml生理盐水和2ml0.25％的胰酶(胰酶终浓度0.05％)；4)混匀消化适量时间(一般1min左右)，看到细胞飘起来或于镜下观本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞外泌体，其特征在于，所述干细胞外泌体由含有改善皮肤的靶基因载体的间充质干细胞分泌，所述靶基因载体包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一种或多种基因。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞外泌体，其特征在于，所述干细胞外泌体由含有改善皮肤的靶基因载体的间充质干细胞分泌，所述靶基因载体包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一种或多种基因。2.一种制备权利要求1所述干细胞外泌体方法，其特征在于，首先对用户肌肤问题进行关于皮肤的基因检测，根据基因检测的结果，寻找到改善其肌肤问题的目的基因，通过体外合成手段对所述目的基因进行扩增，然后将目的基因转至载体制备成靶基因载体，将所述靶基因载体转染进间充质干细胞得到靶基因间充质干细胞，最后将所述靶基因间充质干细胞进行培养，收集其细胞培养液，提取所述细胞培养液中的外泌体，将提取好的外泌体进行灭菌、定量后分装保存；所述测试的基因如下中的一种或多种基因组合：与青春痘形成的相关基因组合：EDAR、CYP21A2、KIF3A、OVOL1、ATP2A2；皮肤防晒能力的相关基因组合：MC1R、OCA2、SOD1、CYP21A2、KIF3A、OVOL1；皮肤抗敏性的相关基因组合：COL5A1、MC1R、KIF3A、OVOL1、SOD1；与雀斑黑色素形成相关的基因组合：MC1R、OCA2、BNC2、TYR；抗皱能力的相关的基因组合：SOD1、GHRHR、EDAR、FLG、MC1R、MMP9；与皮肤防辐射能力及抗衰老能力相关的基因组合：XRCC1、RAD51、HBE1、MMP9、SOD1、CHRHR、KL。3.根据权利要求2所述一种干细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述目的基因包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一种或多种。4.根据权利要求3所述一种干细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述干细胞外泌体制备方法包括以下步骤：（1）将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；（2）将所述目的基因进行扩增，并加入酶切位点，装入载体，得到靶基因载体，将所述靶基因载体转至步骤（1）所述间充质干细胞，得到靶基因间充质干细胞；（3）将步骤（2）中选取的间充质干细胞使用ɑ-MEM空培养基进行培养，培养一段时间后，去除杂质，分离出培养上清液；（4）将步骤（3）所述培养上...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁波，张宜，刘莹，杨前，王刚，陈力，袁紫林，林虹，罗青云，袁贤玲，
申请(专利权)人：深圳市新一仑生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44