一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法，间充质干细胞外泌体制备方法包括：制备间充质干细胞培养基上清液，提取上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。由于使用电转染的方式将目标miRNA负载于间充质干细胞外泌体中，明显提高了外泌体治疗的针对性，加快皮肤伤口的修复；采用先提取间充质干细胞外泌体后电转染的制备步骤，提高了转染的效率，缩短整体制备时间，易控制miRNA用量，提升转染质量；敷料采用负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体结合水凝胶在伤口局部以涂层的方式给药，提高了外泌体及miRNA的利用率，同时将外泌体与水凝胶分开保存，有利于含外泌体敷料的长期保存和长途运输。

A mesenchymal stem cell exosome loaded with target microRNAs, a dressing for application and a preparation method thereof

The invention provides a mesenchymal stem cell exosome loaded with target microRNA, a dressing for application and a preparation method thereof. The preparation method of mesenchymal stem cell exosome includes: preparation of mesenchymal stem cell culture medium supernatant, extraction of mesenchymal stem cell exosome in supernatant, electrotransfection of mesenchymal stem cell exosome, and loading target microRNA. Because the target microRNAs are loaded into the exosome of mesenchymal stem cells by electrotransfection, the pertinence of exosome therapy is obviously improved and the repair of skin wounds is accelerated. The preparation steps of extracting the exosome of mesenchymal stem cells before electrotransfection are adopted to improve the efficiency of transfection, shorten the overall preparation time, control the amount of microRNAs and improve the quality of transfection. Target microRNA mesenchymal stem cell exosome combined with hydrogel was coated on wound, which improved the utilization of exosome and microRNA, and preserved the exosome separately from hydrogel, which was beneficial to the long-term preservation and long-term transportation of dressings containing exosome.

【技术实现步骤摘要】
一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是一组源于基质的异质细胞群，具有自我更新、多向分化潜能，其在组织修复、免疫调节方面有较为显著的能力和广阔前景。间充质干细胞来源广泛，易于获得，可在脂肪、骨髓、牙髓、脐带、脐带血、经血、尿液、角膜等组织中获得。外泌体(exosome)为微小囊泡，直径约为30-140nm，是在生理或病理情况下由多种细胞内膜以出芽方式形成的多泡体，参与细胞间的信息交流，并参与到多种生理病理过程中。来源于不同组织的外泌体本身携带有多种MicroRNA(miRNA)、mRNA、lncRNA、蛋白质、脂质分子等物质，在组织修复过程中，外泌体所负载的生物大分子可以促进控制炎症、促进参与修复的细胞增殖、迁移、促进血管化及再上皮化等。然而，由于其外泌体负载的非特异性，往往促进修复的作用不甚显著。通过生物工程改造外泌体的负载，使之能根据伤口修复的状态负载特异性的促修复因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备间充质干细胞培养基上清液，提取所述上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染所述间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。

【技术特征摘要】
1.一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备间充质干细胞培养基上清液，提取所述上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染所述间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；S12、提取间充质干细胞外泌体：取出所述S11中的培养基上清液，解冻离心后，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的所述培养基上清液超速离心后去上清，PBS重悬并再次超速离心，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；S13、电转染目标miRNA：用电转染缓冲液重悬所述间充质干细胞外泌体，并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将所述外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复，并对其超速离心、去上清、PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其具体步骤包括：S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后按照1:2比例进行接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到70-80％时，使用PBS洗涤3次，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；S12、提取间充质干细胞外泌体：取出所述S11中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的所述培养基上清液在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS重悬并再次在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；S13、电转染目标miRNA：用1ml电转染缓冲液重悬所述间充质干细胞外泌体，通过NTA检测所述间充质干细胞外泌体的浓度并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将所述外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，100000-120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，刘杰，吕其君，
申请(专利权)人：刘波，
类型：发明
国别省市：广东,44