用于检测rs4149056的引物探针组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测rs4149056的引物探针组及其应用。本发明专利技术首先保护一种引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为序列表的序列3所示。本发明专利技术可用于检测rs4149056，判断待测样本基于该位点的基因型，从而指导用用药，具有重大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测rs4149056的引物探针组及其应用
本专利技术涉及一种用于检测rs4149056的引物探针组及其应用。
技术介绍
SLCO1B1基因编码有机阴离子转运多肽OATP1B1,OATP1B1为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，具有介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除的生理功能，在转运他汀类、降糖药、利福平、血管紧张素Ⅱ、受体拮抗剂等药物中发挥重要的调控作用。近年来，SLC01B1基因上已陆续发现多个单核苷酸多态性位点（SNP)，其中有些SNP已经在体外或体内实验中证实与转运功能密切相关。试验证实SLC01B1521T>C基因突变会导致他汀类降脂药普伐他汀的非肾清除率降低，血药浓度增高，具报道521T>C日本人群中的发生频率约为15.8%，在中国人群中的突变发生频率约为14%，与日本相近，提示在东方人群中可能存在相近的发生率。研究还显示SLCO1B1521T>C基因多态性是影响血浆基础胆红素水平的一个重要因素，521T>C突变携带者普伐他汀降低总胆固醇的作用较野生型纯合子携带者显著减弱。对于521T>C位点，突变杂合子和突变纯合子分别占总人数的24.1%和1.96%，野生型纯合子占总人数的73.9%。当SLCO1B1基因发生突变时，其转运功能下降，会严重影响肝脏对药物的吸收，会导致血液中的他汀类药物浓度上升，增加药物的不良反应（如横纹肌溶解症等），进而影响治疗效果。检查SLCO1B1的等位基因521T>C的突变可为临床医生对疾病的诊断和医疗提供重要用药依据。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测rs4149056的引物探针组及其应用。本专利技术首先保护一种引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。探针P为5’末端具有FAM荧光基团且3’末端具有BHQ1荧光淬灭基团的单链DNA分子。具体来说，所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第1-3位核苷酸和第24-26位核苷酸均为锁核酸。所述引物探针组中，引物F、引物R、探针P的摩尔配比为：2.5：15：15。本专利技术还保护所述引物探针组在制备用于检测rs4149056的试剂盒中的应用。本专利技术还保护一种用于检测rs4149056的试剂盒，包括所述引物探针组。本专利技术还保护组件甲和组件乙在制备用于检测rs4149056的试剂盒中的应用；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种用于检测rs4149056的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种试剂盒，包括裂解液。所述试剂盒的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。所述试剂盒还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，包括如下步骤：（1）取抗凝血，加入所述裂解液，颠倒混匀，离心弃上清；（2）完成步骤（1）后，加入所述保存液，先60-70℃（具体可为65℃）水浴，再80-90℃（具体可为85℃）水浴，然后离心，使用时取上清，即为模板样本。所述用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，具体包括如下步骤：（1）取65μLEDTA抗凝血，加入500μL所述裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清；（2）完成步骤（1）后，加入120μL所述保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm离心4min，然后置于4℃保存备用，使用时取上清，即为模板样本。本专利技术还保护特异探针在进行荧光定量PCR检测中的应用；所述特异探针为具有锁核酸修饰的分子信标。本专利技术还保护一种用于荧光定量PCR检测的特异探针，为具有锁核酸修饰的分子信标。以上任一所述rs4149056为人基因组DNA中序列表的序列4所示核苷酸的第56位核苷酸。以上任一所述rs4149056为人基因组中的OATP1B1基因中序列表的序列4所示核苷酸的第33位核苷酸。本专利技术旨在检测OATP1B1基因中最主要的单核苷酸多态性位点的基因分型，判定患者的药物代谢速率类型，从而帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，并降低毒副作用。本专利技术提供的引物探针组，采用分子信标作为探针，并且引入了若干锁核酸。分子信标是一种荧光探针，由环状区和茎干区组成，其茎干区的5'末端标记荧光基团，3'末端标记猝灭基团，闭合时呈发夹结构，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，整体不发出荧光信号。当目标序列存在时，环部与目标序列结合，茎干部分被迫打开，荧光基团远离淬灭基团，发出荧光。具有单核苷酸差异的核苷酸链之间ΔTm值很小，一般检测手段难以区分。锁核酸是一类双环状寡核苷酸衍生物，能够遵循碱基互补配对原则与核酸结合，其结构中的β-D-呋喃核糖的2'-O与4'-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。LNA/DNA杂交双链中，每增加一个LNA单体，Tm提高2-6℃。本专利技术提供的引物探针组的使用方法：用血液样本制备模板样本，然后采用引物探针组进行不平衡的荧光定量PCR扩增，通过观察熔解曲线判断基因型。不平衡扩增：加入过量的与探针反向的引物，少量的与探针同向的引物，以及适量的探针P，经过扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

【技术特征摘要】
1.引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第1-3位核苷酸和第24-26位核苷酸均为锁核酸。3.权利要求1或2所述引物探针组在制备用于检测rs4149056的试剂盒中的应用。4.一种用于检测rs4149056的试剂盒，包括权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛茜，刘婷婷，李朋，赵海文，张可谦，孙辉，管帅，赵斌，
申请(专利权)人：潍坊德诺泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37