一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法；本发明专利技术探针包括3条探针组；3条探针组和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；再结合限制性内切酶的高特异性和对单链DNA切割特性，实现具有非序列依赖性的核酸酶功能的DNA模块，应用于恒温条件下多种miRNA的同时荧光检测。解决常规恒温扩增方法体系复杂问题，为多种miRNA同时灵敏检测提供新方法。本方法仅需添加限制性内切酶和设计简单的探针在不需添加dNTPs条件下即可实现恒温信号扩增检测核酸，且具有良好精确性，重复性和稳定性，适宜发展为试剂盒并向市场推广。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于DNA组装的恒温条件下多种microRNA同时荧光检测方法。
技术介绍
microRNA(miRNA)是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA，在动植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥重要作用。人类约30％的基因受miRNA调控，且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。研究表明，一种miRNA表达水平通常与多种疾病相关。例如，miR-373在乳腺癌、前列腺癌、食道癌以及肝癌中表达增加。Let-7a在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌以及卵巢癌中表达降低。因此，对疾病的精确诊断不能仅通过一种miRNA的表达水平，而通常需要根据多种miRNA的表达水平进行综合判断。由于miRNA的序列短(18-24碱基)，在细胞或者体液内的表达水平非常低，易降解，同源miRNA之间仅相差1-2个碱基，对检测方法的灵敏度和特异性要求极高。Northern印迹技术是当前分析miRNA的常用方法，但方法操作繁琐、耗时长、灵敏度低，需大量样品及分离富集步骤，对RNase污染非常敏感，分析结果误差大。Microarray方法可实现高通量、多组分同时检测miRNA，但方法的特异性和灵敏度较低，芯片制备困难，检测成本高。反转录定量PCR(RT-qPCR)是检测miRNA的金标方法，但由于miRNA序列短，需要先反转录成cDNA才能PCR扩增，方法操作复杂，耗时长，且需要精确的控温仪器，花费高，难于多miRNAs同时检测。近年来发展的核酸恒温扩增技术，其特点是反应过程始终维持在恒定温度，通过添加不同的酶和引物来达到快速扩增目的。但大多数恒温扩增方法依赖复杂的引物设计、聚合酶、切口酶和dNTPs的共同参与。复杂的扩增体系在一定程度上限制了方法的应用范围。发展简单高效恒温扩增方法实现多种miRNA表达水平的同时检测意义重大。
技术实现思路
通过设计三条探针组，并结合限制性内切酶的高特异性和对单链DNA切割特性，实现具有非序列依赖性的核酸酶功能的DNA模块，应用于恒温条件下多种miRNA的同时荧光检测。解决常规恒温扩增方法体系复杂问题，为多种miRNA同时灵敏检测提供新方法。本专利技术的目的之一在于提供一种检测microRNA的探针组。本专利技术的另一目的在于提供一种检测同时检测多种microRNA的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测microRNA的探针组，所述探针组包括Y-1n、Y-2n和荧光探针LP；探针Y-1n、Y-2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；探针Y-1n中间的部分碱基与Y-2n中间的部分碱基反向互补配对，形成“工”字形中间部分的茎部序列；探针Y-1n、Y-2n的另一部分碱基序列与目标microRNA的两端序列分别反向互补配对，形成“工”字形一端的“一”字形头部；探针Y-1n、Y-2n中还存在能与荧光探针LP两端序列分别发生反向互补配对的碱基序列，形成“工”字形另一端的“一”字形头部；荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；荧光探针LP能被切刻内切酶切割；荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。进一步的，所述茎部序列的长度为7～9bp。进一步的，所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。进一步的，荧光探针LP的序列长度为10～18nt。进一步的，荧光探针LP被切刻内切酶切割后能从“工”字形结构中脱落。进一步的，所述切刻内切酶包括Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI。一种检测microRNA的方法，根据所有待检测目标microRNA的序列，对所有目标microRNA分别设计、合成上述任一项所述的探针组，将设计、合成的所有探针组、切刻内切酶与待检测样品混合，于35～50℃反应，然后测定各探针组中所带荧光基团的荧光强度，根据荧光强度值以及相应标准曲线，计算样品中各目标microRNA浓度。进一步的，于35～50℃反应的时间为30～70min。进一步的，切刻内切酶在整个反应体系中的浓度为0.36～0.7U/μL。进一步的，当目标microRNA为miR-373、let-7a和miR-27a时，设计、合成的探针组如SEQIDNO:2～4、SEQIDNO:10～12、SEQIDNO:14～16所示。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术扩增体系简单。本方法仅需添加限制性内切酶和设计简单的探针在不需添加dNTPs条件下即可实现恒温信号扩增检测核酸。2、本专利技术探针和方法非序列依赖。目标miRNA无需含有限制性内切酶识别序列，拓展了限制性内切酶在核酸检测中的应用范围。3、本专利技术探针和方法可用于多目标同时检测。针对多种miRNA，设计相应DNA探针和荧光探针，应用单一限制性内切酶，即可实现检测信号放大，对多种miRNA同时检测。4、本专利技术探针和方法以均相恒温检测为条件。为均相反应，且在恒温条件下无需精确热循环仪器，方法表现出良好精确性，重复性和稳定性，适宜发展为试剂盒并向市场推广。附图说明图1.基于DNA组装的恒温条件下多种miRNA同时荧光检测原理图；图2.各组检测目标miRNA(miR-373)的荧光强度曲线；图3.反应温度对本专利技术方法荧光强度的影响；图4.酶用量对体系荧光强度的影响；图5.不同反应时间对体系荧光强度的影响；图6.本专利技术的特异性检测；图7.多种miRNA的检测结果；(1)miR-373；(2)miR-27a；(3)let-7a；(4)miR-373+miR-27a；(5)miR-373+let-7a；(6)miR-27a+let-7a；(7)miR-373+miR-27a+let-7a；(8)为各种情况的统计；Y探针为0.2mM，LP探针为0.5mM；LP1、LP2、LP3发射波长分别在520、580、663nm(FAM、TAMRA、Cy5)；图8.检测不同miRNA的荧光曲线(a)和标准曲线(b)；图9.不同细胞裂解液内不同miRNA含量。具体实施方式一种检测microRNA的探针组，所述探针组包括Y-1n、Y-2n和荧光探针LP；探针Y-1n、Y-2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；探针Y-1n中间的部分碱基与Y-2n中间的部分碱基反向互补配对，形成“工”字形中间部分的茎部序列；探针Y-1n、Y-2n的另一部分碱基序列与目标microRNA的两端序列分别反向互补配对，形成“工”字形一端的“一”字形头部；探针Y-1n、Y-2n中还存在能与荧光探针LP两端序列分别发生反向互补配对的碱基序列，形成“工”字形另一端的“一”字形头部；荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；荧光探针LP能被切刻内切酶切割，切割后的荧光探针LP能从“工”字形结构中脱落下来；荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。优选的，所述茎部序列的长度为7～9bp。优选的，所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。优选的，荧光探针LP的序列长度为10～18nt。优选的，荧光探针LP被切刻内切酶切割后形成的2个片段均不大于9nt。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测microRNA的探针组，所述探针组包括Y‑1n、Y‑2n和荧光探针LP；探针Y‑1n、Y‑2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；探针Y‑1n中间的部分碱基与Y‑2n中间的部分碱基反向互补配对，形成“工”字形中间部分的茎部序列；探针Y‑1n、Y‑2n的另一部分碱基序列与目标microRNA的两端序列分别反向互补配对，形成“工”字形一端的“一”字形头部；探针Y‑1n、Y‑2n中还存在能与荧光探针LP两端序列分别发生反向互补配对的碱基序列，形成“工”字形另一端的“一”字形头部；荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；荧光探针LP能被切刻内切酶切割；荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测microRNA的探针组，所述探针组包括Y-1n、Y-2n和荧光探针LP；探针Y-1n、Y-2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；探针Y-1n中间的部分碱基与Y-2n中间的部分碱基反向互补配对，形成“工”字形中间部分的茎部序列；探针Y-1n、Y-2n的另一部分碱基序列与目标microRNA的两端序列分别反向互补配对，形成“工”字形一端的“一”字形头部；探针Y-1n、Y-2n中还存在能与荧光探针LP两端序列分别发生反向互补配对的碱基序列，形成“工”字形另一端的“一”字形头部；荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；荧光探针LP能被切刻内切酶切割；荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述茎部序列的长度为7～9bp。3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，荧光探针LP的序列长度为10～18nt。5.根据权利要求1所述的探针组，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宗，陈俊，吕品田，邹小勇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44