一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法；克服现有基因多态性检测技术的缺陷和不足，提供了检测MTHFR和MTRR多态性的引物、探针；该引物、探针能够检测MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，灵敏度高，特异性强，本发明专利技术还提供了一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，此外，本发明专利技术还提供了使用上述试剂盒检测人MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及到一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
叶酸(Folicacid)是一含有蝶啶环的谷氨酸，是人体自身无法合成而需通过食物摄取的B族水溶性维生素，称维生素M、维生素Bc或维生素B9，是米切尔(H.K.Mitchell,1941)从菠菜中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸是细胞生长、分化、修复和宿主防御方面的重要物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸缺乏或代谢障碍会导致DNA生物合成及体内甲基化水平受到干扰，导致疾病的发生。叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。如果在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可引起胎儿神经管发育缺陷，而导致畸形。叶酸是胸腺嘧啶、嘌呤核苷酸合成和同型半胱氨酸(Hcy)再甲基化为甲硫氨酸过程中不可缺少的物质。叶酸缺乏会导致高同型半胱氨酸血症，引起机体出现多系统损伤，也是癌症、慢性萎缩性胃炎、结肠炎、肝细胞受损、血栓闭塞性心脏病、巨幼红细胞性贫血和白细胞减少症、抑郁症、动脉粥样硬化及其他心血管疾病的重要危险因素之一。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成。其基因某些位点变异会对酶的活性和热稳定性产生影响，从而影响叶酸和甲硫氨酸代谢。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。MTHFR677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸(A)变成缬氨酸(V)，引起耐热性和酶活性下降，纯合677TT酶活性下降65％以上，杂合MTHFR677CT活性下降30％，在低叶酸的环境下，纯合677TT可显著升高血浆同型氨酸浓度，从而引起静脉栓塞、肺栓塞、动脉粥样硬化、脑卒中等疾病，带MTHFR677TT基因型的母亲在低叶酸环境情况下生育神经管缺陷的病儿的风险也大增加。MTHFRA1298C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸(E)转变为丙氨酸(A)，也会导致酶活性下降，但下降程度比MTHFRC677T突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接关系，但与MTHFRC677T突变有协同效应。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸保持在无毒水平。其报道最多的单核苷酸多态性是66A>G，中国人群发生率为25.7％，突变导致其酶活与同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血症。因此，对人叶酸代谢基因MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性进行定性检测，可辅助医生对高同型半胱氨酸血症、孕围产期新生儿神经管畸形、妊娠高血压病等疾病的发病风险进行评估，指导叶酸的个体化服用。目前检测叶酸MTHFR和MTRR基因多态性的方法主要有测序法、基因芯片发等。其中测序法检测周期长、操作复杂、灵敏度低而且仪器昂贵，不利于推广；基因芯片发机器要求高，成本昂贵，不利于大规模推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有基因多态性检测技术的缺陷和不足，提供了检测MTHFR和MTRR多态性的引物、探针。该引物、探针能够检测MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，灵敏度高，特异性强，本专利技术还提供了一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性，此外，本专利技术还提供了使用上述试剂盒检测人MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。本专利技术包括如下内容：一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，包括引物组和探针：所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR677C>T位点的引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；针对MTHFR1298A>C位点的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；针对MTRR66A>G位点的引物SEQIDNO.9和SEQIDNO.10，所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR677C>T位点的探针SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；针对MTHFR1298A>C位点的探针SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；针对MTRR66A>G位点的探针SEQIDNO.11和SEQIDNO.12。优选地，所述的试剂盒中所述探针SEQIDNO.3、SEQIDNO.7、SEQIDNO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQIDNO.4、SEQIDNO.8、SEQIDNO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。优选地，所述的试剂盒还包括针对内参基因的引物组和探针，所述引物组包括SEQIDNO.13和SEQIDNO.14，所述探针为SEQIDNO.15。优选地，所述的试剂盒中所述针对内参基因的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ1。优选地，所述的试剂盒包括针对MTHFR677C>T位点的引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，针对MTHFR1298A>C位点的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，以及针对MTRR66A>G位点的引物SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；还包括针对MTHFR677C>T位点的探针SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，针对MTHFR1298A>C位点的探针SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，以及针对MTRR66A>G位点的探针SEQIDNO.11和SEQIDNO.12。优选地，所述的试剂盒中探针SEQIDNO.3、SEQIDNO.7、SEQIDNO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQIDNO.4、SEQIDNO.8、SEQIDNO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。优选地，所述的试剂盒还包括PCR预混液，PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和dUTP。优选地，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为7种重组质粒的混合液，所述7种重组质粒为含有MTHFR677C、MTHFR66T、MTHFR1298A、MTHFR1298C、MTRR66A、MTRR66G和GUSB序列的重组质粒，所述阴性对照品为灭菌超纯水。一种检测人MTHFR和M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括引物组和探针：所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；针对MTHFR 1298A>C位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；针对MTRR 66A>G位点的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR 677C>T位点的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对MTHFR 1298A>C位点的探针SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；针对MTRR 66A>G位点的探针SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

【技术特征摘要】
1.一种检测人MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括引物组和探针：所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR677C>T位点的引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；针对MTHFR1298A>C位点的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；针对MTRR66A>G位点的引物SEQIDNO.9和SEQIDNO.10，所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR677C>T位点的探针SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；针对MTHFR1298A>C位点的探针SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；针对MTRR66A>G位点的探针SEQIDNO.11和SEQIDNO.12。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针SEQIDNO.3、SEQIDNO.7、SEQIDNO.11的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针SEQIDNO.4、SEQIDNO.8、SEQIDNO.12的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括针对内参基因的引物组和探针，所述引物组包括SEQIDNO.13和SEQIDNO.14，所述探针为SEQIDNO.15。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ1。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对MTHFR677C>T位点的引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，针对MTHFR1298A>C位点的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，以及针对MTRR66A>G位点的引物SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；还包括针对MTHFR677C>T位点的探针SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，针对MTHFR1298A>C位点的探针SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，以及针对MTRR66A>G位点的探针SEQIDNO.11和SEQIDNO.12。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨欢欢，陈正涛，李兴民，
申请(专利权)人：浙江数问生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33