一种MKi67基因表达检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种MKi67基因表达检测试剂盒及其检测方法；包括检测MKi67基因表达的引物、探针；该引物、探针能够检测MKi67基因表达水平，灵敏度高，特异性强；本发明专利技术还提供了一种MKi67基因表达检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测MKi67基因表达水平；此外，本发明专利技术还提供了使用上述试剂盒检测MKi67基因表达的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

A Kit for Detecting MKi67 Gene Expression and Its Detection Method

The invention provides an MKi67 gene expression detection kit and its detection method, including primers and probes for detecting MKi67 gene expression; the primers and probes can detect MKi67 gene expression level with high sensitivity and specificity; the invention also provides a MKi67 gene expression detection kit, which can quickly, efficiently and accurately detect MKi67 gene expression level; In addition, the invention also provides a detection method for MKi67 gene expression using the above kit. The method has the advantages of simple operation, high sensitivity, high specificity, real, reliable and easy to popularize.

【技术实现步骤摘要】
一种MKi67基因表达检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及到一种MKi67基因表达检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
临床上发现乳腺癌组织学类型和病理分期相同的患者，在临床表现、治疗反应性和预后等方面有相当大的差异，其原因在于乳腺癌存在不同的分子分型。以肿瘤细胞分子表达差异为基础的乳腺癌分子分型的提出对于解决肿瘤的异质性、分期的合理性、预后判断的准确性及乳腺癌的个体化治疗将提供重要的依据。LuminalA型乳腺癌病理IHC表达情况为：ER/PR阳性，且PR高表达(≥20％)，HER2阴性，Ki-67低表达。luminalA型是乳腺癌中预后最好的1个亚型，以早期患者居多，复发风险较低。治疗方面，luminalA型对内分泌治疗敏感。LuminalB型乳腺癌分为两种，病理IHC表达情况分别为：LuminalB(HER-2阴性)，ER和(或)PR阳性，HER-2阴性，Ki-67高表达；LuminalB(HER-2阳性)，ER和(或)PR阳性，HER-2过表达或增殖Ki-67任何水平。LuminalB型多见于高龄乳腺癌患者，此亚型也属于内分泌治疗敏感的肿瘤，但由于HER-2阳性，对他莫昔芬的疗效较luminalA型差，对芳香化酶抑制剂的效果较好，部分患者可进行分子靶向治疗。肿瘤增殖活性是其侵袭能力的重要指标，而且与患者的化疗敏感性密切相关。Ki-67的表达会影响乳腺癌的分子分型，是区分LuminalA型和LuminalB型的关键指标，因此成为乳腺癌临床诊疗中的重要指标。目前常用的乳腺癌分型方法是利用免疫组织化学(IHC)这种在病理科进行的半定量的方法，用抗体对肿瘤组织中ER、PR、HER-2以及Ki-67这四种蛋白进行检测。但根据美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理医生协会(CAP)的联合研究，由于受免疫组织化学技术本身所限，每五个乳腺癌患者就有一个可能由于IHC检测不准确而接受了错误的治疗方案：且目前使用的Ki67免疫组织化学(IHC)检测无法进行有效的实验室质量控制，即使在全世界最好的几个病理实验室之间也存在着相当大的不一致性，使得免疫组化Ki-67检测的准确性和临床参考意义大打折扣。
技术实现思路
本专利技术提供了检测MKi67基因表达的引物、探针。该引物、探针能够检测MKi67基因表达水平，灵敏度高，特异性强。本专利技术还提供了一种MKi67基因表达检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测MKi67基因表达水平。本专利技术还提供了使用上述试剂盒检测MKi67基因表达的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，检测结果真实可靠且易于推广等优点。本专利技术包括如下内容：一种MKi67基因表达检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括引物与探针；所述的针对MKi67基因mRNA引物组为如下引物组中的至少一组：：MKi67-Fo：agccagcacgtcgtgtctC；MKi67-Re：TAGGCCTTGGAATCTTGAGCTT；所述的相对应的探针为：MKi67-Pr：FAM-ctagcttctcttctgaccctG-MGB。优选地，所述的MKi67基因表达检测试剂盒还包括针对内参CALM2基因和B2M基因mRNA检测的引物与相对应的探针：所述的引物为：CALM2-Fo：ataaggatggcaatggctatattagt；CALM2-Re：TTCCCTGATCATTTCATCAACTTC；B2M-Fo：acagcccaagatagttaagtggg；B2M-Re：AAGCAGAATTTGGAATTCATCCA；所述的检测探针如下：CALM2-Pr:HEX-cttcgccatgtgatgaca-MGB；B2M-Pr:CY5-atgtaagcagcatcatggA–MGB。优选地，所述的MKi67基因表达检测试剂盒包括针对MKi67基因mRNA引物组：MKi67-Fo：agccagcacgtcgtgtctC；MKi67-Re：TAGGCCTTGGAATCTTGAGCTT；所述的相对应的探针为：MKi67-Pr：FAM-ctagcttctcttctgaccctG-MGB。一种MKi67基因表达检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括针对MKi67基因mRNA和内参CALM2基因和B2M基因mRNA检测的引物以及探针，所述的检测引物如下：MKi67-Fo：agccagcacgtcgtgtctC；MKi67-Re：TAGGCCTTGGAATCTTGAGCTT；CALM2-Fo：ataaggatggcaatggctatattagt；CALM2-Re：TTCCCTGATCATTTCATCAACTTC；B2M-Fo：acagcccaagatagttaagtggg；B2M-Re：AAGCAGAATTTGGAATTCATCCA；所述的检测探针如下：MKi67-Pr：FAM-ctagcttctcttctgaccctG-MGB；CALM2-Pr:HEX-cttcgccatgtgatgaca-MGB；B2M-Pr:CY5-atgtaagcagcatcatggA–MGB。优选地，所述的MKi67基因表达检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括MKi67探针引物混合液、酶混合液、阴性对照品、阳性对照品；所述的MKi67引物探针混合液中0.2-1uM引物、0.2-1uM探针；所述的酶混合液包括逆转录酶、DNA聚合酶、0.25mMdNTP、3mMMgCl2、PCRbuffer；所述的阴性对照品为灭菌超纯水；所述的阳性对照品为体外转录的MKi67基因、CALM2基因和B2M基因片段RNA混合液。一种检测MKi67基因表达的方法，所述的检测方法包括使用MKi67基因表达的引物、探针或检测MKi67基因表达的试剂盒检测MKi67基因表达的步骤；所述检测方法采用多重荧光定量PCR技术进行MKi67基因表达的检测，具体步骤如下：步骤一、提取待检的肿瘤样本RNA，作为检测模板；步骤二、体系配制根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联PCR反应管；步骤三、分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中；步骤四、进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：50℃10分钟；94℃10分钟；94℃30秒，60℃30秒收集荧光信号，50个循环；步骤五、检测数据分析MKi67基因定量结果以40-ΔΔCq公式进行处理，获得代表每个患者样本MKi67基因表达水平的分值。与现有技术相比，本专利技术有以下优点：(1)灵敏度高：可以在100000拷贝野生型基因组DNA背景下准确检出0.01％放入突变DNA；(2)特异性高：能耐受100000拷贝的野生型基因组DNA，而不出现非特异性扩增；(3)使用多重荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭关反应，且添加防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行突变检测，确保结果真实可信；(4)操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析，适用于大规模推广应用。本专利技术的具体组分见下表：与现有技术相比，本专利技术有以下优点：1、所需样本量少，使用多重荧光PCR技术进行检测，含有内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行检测，确保结果真实可信；2、较I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MKi67基因表达检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括引物与探针；所述的针对MKi67基因mRNA引物组为如下引物组中的至少一组：：MKi67‑Fo：agccagcacgtcgtgtctC；MKi67‑Re：TAGGCCTTGGAATCTTGAGCTT；所述的相对应的探针为：MKi67‑Pr：FAM‑ctagcttctcttctgaccctG‑MGB。

【技术特征摘要】
1.一种MKi67基因表达检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括引物与探针；所述的针对MKi67基因mRNA引物组为如下引物组中的至少一组：：MKi67-Fo：agccagcacgtcgtgtctC；MKi67-Re：TAGGCCTTGGAATCTTGAGCTT；所述的相对应的探针为：MKi67-Pr：FAM-ctagcttctcttctgaccctG-MGB。2.根据权利要求1中所述的MKi67基因表达检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒还包括针对内参CALM2基因和B2M基因mRNA检测的引物与相对应的探针：所述的引物为：CALM2-Fo：ataaggatggcaatggctatattagt；CALM2-Re：TTCCCTGATCATTTCATCAACTTC；B2M-Fo：acagcccaagatagttaagtggg；B2M-Re：AAGCAGAATTTGGAATTCATCCA；所述的检测探针如下：CALM2-Pr:HEX-cttcgccatgtgatgaca-MGB；B2M-Pr:CY5-atgtaagcagcatcatggA–MGB。3.根据权利要求1中所述的MKi67基因表达检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括针对MKi67基因mRNA引物组：MKi67-Fo：agccagcacgtcgtgtctC；MKi67-Re：TAGGCCTTGGAATCTTGAGCTT；所述的相对应的探针为：MKi67-Pr：FAM-ctagcttctcttctgaccctG-MGB。4.根据权利要求2所述的MKi67基因表达检测试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兴民，彭冲，
申请(专利权)人：浙江数问生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33