本发明专利技术公开了基于焦磷酸测序技术的TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化检测的方法，以此实现TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的定量检测。其中所使用的针对该段基因的特异性扩增引物序列如TIMP3‑F和TIMP3‑R所示，针对扩增引物进行焦磷酸测序的测序引物如TIMP3‑S所示。本发明专利技术中所示引物及方法将有助于对肿瘤进行早期诊断，对癌症筛查具有重要意义。
Detection of CPG island methylation in promoter region of TIMP3 gene based on pyrophosphate sequencing
The invention discloses a method for detecting CPG island methylation in the promoter region of TIMP3 gene based on pyrophosphate sequencing technology, thereby realizing quantitative detection of CPG island methylation in the promoter region of TIMP3 gene. The sequence of specific amplified primers for this gene is shown in TIMP3 F and TIMP3 R. The sequence primers for pyrophosphate sequencing for amplified primers are shown in TIMP3 S. The primers and methods shown in the invention are helpful for early diagnosis of tumors and are of great significance for cancer screening.
【技术实现步骤摘要】
基于焦磷酸测序技术的TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化检测方法
本专利技术涉及TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化水平检测。
技术介绍
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)适用于对已知的短序列进行高通量的、精确的和重复性好的测序分析，可应用于单核苷酸多态性(singleucleotidepolymor—phism，SNP)、肿瘤甲基化分析等多项研究。该方法在甲基化水平检测中被誉为“金标准”。其原理为引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶存在的反应体系中，依次加入4种dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)之一，如若发生碱基互补配对，通过多级反应最终会产生氧化荧光素，发出光信号，从而确定该处碱基。随着该过程循环进行,互补DNA链逐渐合成,DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。恶性肿瘤为多因素、多阶段形成，其浸润和转移也涉及穿过细胞外基质屏障、血管基底膜及穿出血管壁等过程，其中的必要条件为基底膜和细胞外降解。除了因DNA序列的改变而产生突变，造成肿瘤发生，表遗传学上的改变也会影响肿瘤的产生。肿瘤组织DNA常常发生其启动子区域的异常甲基化,包括原癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化改变,一方面激活了癌基因，同时也使抑癌基因失活。通常启动子区域CpG岛的高甲基化是导致肿瘤发生发展的重要分子生物学机制。组织金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinases,TIMPs)家族共有4个成员，它们按照被发现的顺序依次被命名。其中TIMP3与其他3个成员不同，它主要定位结合于组织的细胞外基质层中，这也决定了它的作用方向。TIMP3基因位于人类染色体22q12.1-13.2上，由它编码产生的蛋白质在细胞外合成后被分泌到细胞内基质中，能拮抗基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)的活性，这一特异性抑制作用，维持着细胞外基质的降解与合成的平衡，在抑制肿瘤侵袭转移中起重要作用。TIMP3基因可以抑制肿瘤生长、血管生成，影响肿瘤的侵袭、浸润和转移,是一种抑癌基因。同时它也是细胞凋亡相关基因，有促进凋亡的作用。TIMP3表达降低或缺失与肿瘤发生密切相关，其启动子甲基化也影响多种肿瘤的预后情况，如胃癌、肾癌、胶质瘤、结肠癌、乳腺癌等。TIMP3基因启动子区域CPG岛的甲基化水平变化存在于多种恶性肿瘤中，其可能作为肿瘤检测的标志物，有助于肿瘤的早期筛查，为肿瘤治疗提供帮助。
技术实现思路
本专利技术中涉及位于人类染色体chr22:32801395-32802281的TIMP3基因，通过PCR扩增出TIMP3启动子区域CPG岛部分的DNA片段，利用焦磷酸测序技术检测其每个甲基化位点的甲基化频率，测得的甲基化频率范围为0％-100％，可做到定量分析，测序结果精确、灵敏度高。本专利技术目的在于提供一种检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化程度的试剂盒，涉及基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的测序引物。包括特异性扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R，其中TIMP3-R的5’端添加生物素标记，以及对扩增出的片段进行焦磷酸测序的测序引物TIMP3-S。引物序列为：TIMP3-F：5’-AGTTGGAGTTTGGGGGATTG-3’TIMP3-R：5’-AACATCTTCCCCTCTCAACT-3’TIMP3-S：5’-AGTTTGGGGGATTGG-3’PCR扩增的反应条件为：95℃15分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，47个循环；72℃10分钟。本专利技术涉及基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的实方法，方法包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将样本DNA中未甲基化的碱基C转化为碱基T，处理方式为将浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μgDNA的水溶液混合置于98℃，10min，然后64℃，2.5个小时，并对DNA进行纯化得到DNA模板；(3)利用得到的DNA模板，使用扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R经PCR扩增得到所需DNA片段；(4)取6μlPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功，并根据100bp标记条带之下是否有条带来判断是否有引物二聚体；(5)对于扩增成功且无明显引物二聚体的样品，将剩余扩增产物进行焦磷酸测序，使用的测序引物为TIMP3-S(6)依据PyroMark测序报告得到测序序列中每个甲基化位点的甲基化频率，所测序列为：GGYGTYGAGGYGTGTATATGTTYGTTTAGTTATTTTTAGGAYGTTTTTTGTAATTTYGATATYGGTAAGYGTTTTTGGTGTTTYGTTYGAGTTTTAYGTTGTAGTTAGGATTGTAGYGTTGTTTAGGGAGGTAGGGYGAGTTTTATTTTTTTTTTTTGTTTT。本专利技术提供一种检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化水平的试剂盒。试剂盒的内容包括扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R，其中TIMP3-R的5’端含有生物素标记；测序引物TIMP3-S；PCR扩增部分的试剂，包括：热启动DNA聚合酶(HotStarTaqDNAPolymerase)、PCR缓冲液(Tris-HCL缓冲液)、dNTPs。对于试剂盒不涉及的部分：可使用QIAGEN公司的PyroMarkQ96试剂盒对应Q96的仪器使用。附图说明图1为本专利技术中包含的引物序列以及测序序列相关信息，带圈箭头所属序列为包含生物素标记的序列。由于测序序列过长显示不全，附完整测序序列，序列中所示的Y碱基位点为之后测定甲基化水平的位点；完整测序序列：GGYGTYGAGGYGTGTATATGTTYGTTTAGTTATTTTTAGGAYGTTTTTTGTAATTTYGATATYGGTAAGYGTTTTTGGTGTTTYGTTYGAGTTTTAYGTTGTAGTTAGGATTGTAGYGTTGTTTAGGGAGGTAGGGYGAGTTTTATTTTTTTTTTTTGTTTT图2为PCR扩增得到的TIMP3启动子区域CPG岛部分片段的琼脂糖凝胶电泳图；图3为焦磷酸测序结果，竖条区域为测定的甲基化位点，竖条上方百分比数值为该点甲基化水平。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术进行进一步阐述。本专利技术的优点在于所有操作步骤及得出结果可在一天内完成，方便快捷，且测序结果由软件计算得出，避免主观分析造成的误差，结果可信度高。实例一：细胞样本中TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化检测1.从细胞样本中提取基因组DNA。取在75cm2培养瓶中培养的A549细胞，使用PBS清洗两遍后由胰酶消化，收集细胞悬液于离心管中，于800r/min2min离心并由PBS清洗后备用。应用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，依据说明书操作步骤，提取得到基因组DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的特异性扩增引物TIMP3‑F和TIMP3‑R，其中TIMP3‑R的5’端添加生物素标记；基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的的测序引物TIMP3‑S；引物序列为：TIMP3‑F：5’‑AGTTGGAGTTTGGGGGATTG‑3’TIMP3‑R：5’‑AACATCTTCCCCTCTCAACT‑3’TIMP3‑S：5’‑AGTTTGGGGGATTGG‑3’。
【技术特征摘要】
1.基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的特异性扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R，其中TIMP3-R的5’端添加生物素标记；基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的的测序引物TIMP3-S；引物序列为：TIMP3-F：5’-AGTTGGAGTTTGGGGGATTG-3’TIMP3-R：5’-AACATCTTCCCCTCTCAACT-3’TIMP3-S：5’-AGTTTGGGGGATTGG-3’。2.应用如权利要求1所述引物的方法，其特征在于，扩增的反应条件为：95℃15分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，47个循环；72℃10分钟。3.基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的实方法，其特征在于，步骤包括：一、提取样本中的DNA；二、将样本DNA中未甲基化的碱基C转化为碱基T，处理方式为将180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μgDNA的20μl水溶液混合置...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄映辉，梁天亚，马羚，
申请(专利权)人：黄映辉，
类型：发明
国别省市：北京,11
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