用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法，试剂盒，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06‑0.15U/ul USER酶，PCR扩增体系，磁珠；检测方法通过建立测序文库进行ccfDNA的全基因组测序；再经过全基因组数据处理、建立统计和建立机器学习模型来检测病人ccfDNA的拷贝数的异常从而达到肝癌的早期诊断；这样的检测方法最大限度的提高液体活检对早期肝癌诊断的准确性，特别是对肝癌一期的检测。

【技术实现步骤摘要】
用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及肝癌诊断辅助领域，特别是一种用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
肝癌是恶性度非常高的肿瘤，一旦转移基本没有有效的治疗方案，存活率很低。肝癌如果诊断在早期，还可以接受手术或者肝移植的时候，五年存活率可以达到70％。如果已经转移的话，五年存活率只有5％左右。所以早期诊断对病人的生存至关重要。常规的肝癌的诊断主要是通过甲胎蛋白(AFP)进行筛查，对于高风险人群再通过超声，核磁等影像学手段进一步检查，发现可疑病灶时确诊的手段是肝穿刺活检。但是，超声的灵敏度有限，而且不能确诊。常规的肝穿刺活检有很大的侵入性，而且有引起肿瘤扩散的风险。由于肿瘤有普遍的肿瘤内的异质性，很多时候肝穿刺活检并不能显示肿瘤的全貌。对应于影像学检查和肝穿刺活检，市场更需要一种使用液体活检来完成肝癌的早期诊断的非侵入性手段。液体活检主要依赖灵敏的技术来检测血液里的游离的DNA(ccfDNAs)里面的肿瘤特有的DNA(循环肿瘤DNA,circulatingtumorDNA，ctDNA)；如图3所示，由于释放到血液里的肿瘤DNA的量跟肿瘤的大小和肿瘤的临床分期密切相关，而早期的肿瘤释放到血液里的DNA很少，用液体活检来诊断早期肿瘤有很大的挑战。市场需要针对早期肝癌诊断的试验手段，计算方法和机器学习模型，来最大限度的提高液体活检对早期肝癌诊断的准确性；本专利技术解决这样的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法，本专利技术通过建立测序文库进行ccfDNA的全基因组测序；再经过全基因组数据处理、通过机器学习来建立统计模型来检测病人ccfDNA的拷贝数的异常从而达到肝癌的早期诊断，这样的检测方法最大限度的提高液体活检对早期肝癌诊断的准确性，特别是对一期肝癌的检测。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06-0.15U/ulUSER酶，PCR扩增体系，磁珠。前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，ccfDNA末端处理体系组成有：ccfDNA，0.003-0.007U/ul的T4DNA聚合酶，0.1-0.3U/ul的T4多聚核苷酸激酶，0.0015-0.0035U/ul的TaqDNA聚合酶，1xT4DNA连接酶缓冲液，0.2-0.6mMdNTP,0.1-0.3mMATP，2.5％的粘合剂。前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，环状接头反应体系组成有：0.1-0.3U/ul的T4连接酶，1xT4连接酶缓冲液，和0.7-1.2uM的环状接头，所述环状接头序列：5’-P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCdUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，PCR扩增体系按照体积份数组成有：15-25份DNA片段，3-8份的引物1和引物2，20-30份的PCR反应mastermix；所述Mastermix包括：2xPCR多聚酶和2x的PCR反应缓冲液。所述引物1的3’端与环状接头的5’端互补，5’端是用于Illumina测序的P7引物，中间是标签；所述引物2的3’端与环状接头的3’端互补，5’端是用于Illumina测序的P5引物。前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，所述引物1的序列为：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中NNNNNN是核苷酸的标签；所述引物2的序列为：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，包括如下内容：十一，从血浆中分离得到ccfDNA；十二，用ccfDNA末端处理体系对ccfDNA进行末端修复，对5’末端磷酸化，加上polyA尾端，得到DNA片段；十三，用环状接头反应体系对得到的DNA片段两端加上环状接头，将环状接头中间用USER酶切开，产生两个互补的单链；十四，用PCR扩增体系对DNA片段进行PCR扩增；十五，采用测序仪对扩增后的产物进行高通量测序；十六，把基因组分成1Mbp的不重合的区域，在每个区域里，用测序深度的加和代表这个区域的拷贝数的量化；十七，用统计算法计算全基因组的拷贝数，然后计算全基因组的拷贝数负荷，用拷贝数负荷来诊断肝癌；十八，挖掘TCGA公共数据库里的肝癌多组学数据，建立贝叶斯非参统计模型量化每个基因是驱动基因的潜力；十九，建立有权重的随机森林的机器学习模型捕获早期肝癌的信号；二十，根据TCGA公共数据库里的数据学到了的驱动基因和拷贝数作为权重，再把权重用在权重随机森林的模型里的训练集上做模型。用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，包括如下内容：一，从血浆中分离得到ccfDNA；二，用ccfDNA末端处理体系对ccfDNA进行末端修复，对5’末端磷酸化，加上polyA尾端，得到DNA片段；三，用环状接头反应体系对得到的DNA片段两端加上环状接头，将环状接头中间用USER酶切开，产生两个互补的单链；四，用PCR扩增体系对DNA片段进行PCR扩增；五，采用测序仪对扩增后的产物进行高通量测序；六，用和平滑模型对GC含量和基因组mappability文件进行校正；校正GC含量、基因组mappability文件的模型的公式为：xi是GC含量，是核平滑后的对应于xi的reads数，常数其中是所有GC含量里的reads平均数。七，把基因组分成1Mbp的不重合的区域，在每个区域里把校正后的测序深度加和来代表这个区域的拷贝数的量化；八，用统计算法计算每个片段的拷贝数，然后计算全基因组的拷贝数负荷，用拷贝数负荷来诊断肝癌；九，挖掘TCGA公共数据库里的肝癌多组学数据，建立贝叶斯非参统计模型量化每个基因是驱动基因的潜力；十，建立有权重的随机森林的机器学习模型捕获早期肝癌的信号；十一，根据TCGA公共数据库里的数据学到了的驱动基因和拷贝数作为权重，再把权重用在权重随机森林的模型里的训练集上做模型。前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，用统计算法计算全基因组的拷贝数，然后计算全基因组的拷贝数负荷，用拷贝数负荷来诊断肝癌；具体步骤如下：先校正比对在每个1000bp区域的测序深度，然后用隐马尔科夫模型平滑相邻区域的校正后的测序深度，这样整个基因组分成连续的大片段，每个大片段有个相对的拷贝数的变化，把这些有拷贝数变化的大片段的长度乘以他们各自的相对的拷贝数，然后把这些数值加和，作为这个基因组的拷贝数的负荷；用大样本的乙肝来建立拷贝数的分布，如果低于这个分布的99％的分位数记为零，负荷为零的判断为乙肝，高于零的数值代表具有肝癌的可能性，数越高肝癌的可能性越大。前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，建立有权重的随机森林的机器学习模型捕获早期肝癌的信号；具体的步骤如下：生成随机森林的输入数据矩阵，列代表每个区域是校正过的测序深度，行是每个样本；建立常规随机森林里的一个二叉树，所述二叉树的每一个分叉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06‑0.15U/ul USER酶，PCR扩增体系，磁珠。

【技术特征摘要】
1.用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06-0.15U/ulUSER酶，PCR扩增体系，磁珠。2.根据权利要求1所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述ccfDNA末端处理体系组成有：ccfDNA，0.003-0.007U/ul的T4DNA聚合酶，0.1-0.3U/ul的T4多聚核苷酸激酶，0.0015-0.0035U/ul的TaqDNA聚合酶，1xT4DNA连接酶缓冲液，0.2-0.6mMdNTP,0.1-0.3mMATP，2.5％的粘合剂。3.根据权利要求1所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，环状接头反应体系组成有：0.1-0.3U/ul的T4连接酶，1xT4连接酶缓冲液，和0.7-1.2uM的环状接头，所述环状接头的序列为：5’-P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCdUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。4.根据权利要求1所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系按照体积份数组成有：15-25份DNA片段，3-8份的引物1和引物2，20-30份的PCR反应mastermix；所述引物1的3’端与环状接头的5’端互补，5’端是用于Illumina测序的P7引物，中间是标签；所述引物2的3’端与环状接头的3’端互补，5’端是用于Illumina测序的P5引物；所述PCR反应mastermix包括：2xPCR多聚酶和2x的PCR反应缓冲液。5.根据权利要求4所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述引物1的序列为：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中NNNNNN是核苷酸的标签；所述引物2的序列为：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。6.用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下内容：一，从血浆中分离得到ccfDNA；二，用ccfDNA末端处理体系对ccfDNA进行末端修复，对5’末端磷酸化，加上polyA尾端，得到DNA片段；三，用环状接头反应体系对得到的DNA片段两端加上环状接头，将环状接头中间用USER酶切开，产生两个互补的单链；四，用PCR扩增体系对DNA片段进行PCR扩增；五，采用测序仪对扩增后的产物进行高通量测序；六，把基因组分成1Mbp的不重合的区域，在每个区域里，用测序深度的加和代表这个区域的拷贝数的量化；七，用统计算法计算每个片段的拷贝数，然后计算全基因组的拷贝数负荷，用拷贝数负荷来诊断肝癌；八，挖掘TCGA公共数据库里的肝癌多组学数据，建立贝叶斯非参统计模型量化每个基因是驱动基因的潜力；九，建立有权重的随机森林的机器学习模型捕获早期肝癌的信号；十，根据TCGA公共数据库里的数据学到了的驱动基因和拷贝数作为权重，再把权重用在权重随机森林的模型里的训练集上做模型。7.用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下内容：一，从血浆中分离得到ccfDNA；二，用ccfDNA末端处理体系对ccfDNA进行末端修复，对5’末端磷酸化，加上polyA尾端，得到DNA片段；三，用环状接头反应体系对得到的DNA片段两端加上环状接头，将环状接头中间用USER酶切开，产生两个互补的单链；四，用PCR扩增体系对DNA片段进行PCR扩增；五，采用测...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨楚虎，张琼，
申请(专利权)人：杭州翱锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33