本发明专利技术提供了一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法；包括检测人类微卫星不稳定性状态MSI的引物、探针。该引物、探针能够检测人类微卫星不稳定性状态MSI，灵敏度高，特异性强；本发明专利技术还提供了一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人类微卫星不稳定性状态；此外，本发明专利技术提供了使用上述试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及到人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
目前，肿瘤已经成为中国主要死亡原因且肿瘤负担仍在持续上升。据2018年中华医学会发布的《中国肿瘤防治进展》报告显示，中国平均每天约有1万人确诊癌症、7500名癌症患者死亡，因此肿瘤药物开发、治疗疗法的研究日趋重要。近几年，随着精准医疗与个体化医疗的发展，新的肿瘤靶向药物研发及不断深入研究，通过基因检测预测个体化用药也随之成为当前的发展趋势。微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)是一种由于基因复制错误而引起的简单重复序列发生改变。MSI的存在预示着细胞在错误修复的DNA序列方面存在缺陷，这与恶性肿瘤(尤其是消化系统恶性肿瘤及妇科肿瘤)的形成密切相关。MSI根据其改变程度分为高频MSI(MSI-H)、低频MSI(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)，研究表明检测患者的MSI分型具有重要临床意义。据报道，MSI检测被认为可对结直肠癌以及直肠癌的辅助治疗提供依据，NCCN发布的结肠癌和直肠癌临床实践指南推荐所有具有结直肠癌与直肠癌患病史的病人进行MSI检测，以指导临床用药和免疫治疗、诊断林氏综合征(Lynchsyndrome)。有大量的研究表明MSI状态对于决定结直肠癌患者是使用5-FU治疗还是伊立替康治疗很重要，MSI结直肠癌以及其他类型MSI癌症晚期患者利用PD-1单抗免疫治疗获益较大。NCCN推荐PD-1免疫治疗单抗pembrolizumab和nivolumab用于dMMR/MSI-H结直肠癌晚期治疗。由此可见，随着药物的研究机理的愈加明确化，MSI检测将具有很大市场前景。目前检测肿瘤细胞中MSI时，既可以依赖分子水平(包括多重PCR-毛细管电泳以及NGS)来检测MSI现象，也可以通过免疫组化检测MMR基因缺陷。
技术实现思路
本专利技术提供了检测人类微卫星不稳定性状态MSI的引物、探针。该引物、探针能够检测人类微卫星不稳定性状态MSI，灵敏度高，特异性强。本专利技术还提供了一种一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人类微卫星不稳定性状态。本专利技术还提供了使用上述试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。本专利技术包括如下内容：一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括针对针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物，所述的检测引物如下：BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTBAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttcBAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCCBAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCCNR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAANR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTCNR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGACNR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCANR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACTNR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACCMONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTGMONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTGPentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcagPentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCTPentaD-Fo：TAMRA-atttgcctaacctatggtCATAACGPentaD-Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGAAmel-Fo：FAM-ccctgggctctgtaaagaatagAmel-Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA。优选地，所述的人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒包括MSI引物混合液、PCR预混液、阴性对照品、阳性对照品；所述的MSI引物混合液包含用于检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点及1个性别鉴定基因的引物，6个单核苷酸重复位点分别为BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27，2个五核苷酸重复位点为PentaC、PentaD，性别鉴定基因为Amel；所述的PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、dNTPs和dUTP；所述的阴性对照品为灭菌超纯水；所述的阳性对照品为细胞系HT-29基因组DNA。一种人类微卫星不稳定性状态MSI的检测方法，所述的检测方法包括使用人类微卫星不稳定性状态MSI的引物或检测人类微卫星不稳定性状态MSI的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的步骤；所述检测方法采用多重荧光定量PCR技术结合毛细管电泳进行序列片段分析人类细胞中微卫星不稳定状态，具体步骤如下：步骤一、提取待检的同一个体的肿瘤样本和对照样本DNA，作为检测模板；步骤二、荧光PCR扩增根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联PCR反应管；步骤三、分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中；步骤四、进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：37℃2分钟；94℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，70℃1分钟，35个循环；60℃45分钟；4℃∞；步骤五、荧光PCR产物毛细管电泳；制备毛细管样品，以基因分析仪进行毛细管电泳检测；步骤六、检测数据分析检测数据使用分析软件进行数据分析，根据判定标准判定微卫星不稳定状态。综上，本专利技术提供的一种检测人类微卫星不稳定性状态的特异性引物，所述引物分别为针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物。检测引物如下：BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTBAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttcBAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCCBAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCCNR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAANR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTCNR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGACNR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCANR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACTNR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACCMONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTGMONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTGPentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcagPentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCTPentaD-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物，所述的检测引物如下：BAT‑25‑Fo：FAM‑CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTBAT‑25‑Re：ctatggctctaaaatgctctgttcBAT‑26‑Fo：TAMRA‑TGACTACTTTTGACTTCAGCCBAT‑26‑Re：AACCATTCAACATTTTTAACCCNR‑21‑Fo：VIC‑CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAANR‑21‑Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTCNR‑24‑Fo：VIC‑GCTGAATTTTACCTCCTGACNR‑24‑Re：GGAGATTGTGCCATTGCANR‑27‑Fo：FAM‑AACCATGCTTGCAAACCACTNR‑27‑Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACCMONO‑27‑Fo：TAMRA‑AAGGGTGGATCAAATTTCACTTGMONO‑27‑Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTGPentaC‑Fo：VIC‑gaacacactttgcacctgtcagPentaC‑Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCTPentaD‑Fo：TAMRA‑atttgcctaacctatggtCATAACGPentaD‑Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGAAmel‑Fo：FAM‑ccctgggctctgtaaagaatagAmel‑Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA。...
【技术特征摘要】
1.一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物，所述的检测引物如下：BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTBAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttcBAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCCBAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCCNR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAANR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTCNR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGACNR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCANR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACTNR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACCMONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTGMONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTGPentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcagPentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCTPentaD-Fo：TAMRA-atttgcctaacctatggtCATAACGPentaD-Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGAAmel-Fo：FAM-ccctgggctctgtaaagaatagAmel-Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA。2.根据权利要求1所述的人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨欢欢，罗欢，李兴民，
申请(专利权)人：浙江数问生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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