一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒。miRNA647作为检测非小细胞肺癌的miRNA标志物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。本发明专利技术发现了miRNA647表达水平与非小细胞肺癌的发生有关，通过检测血液中miRNA647的表达水平，结合临床症状可以判断其是否患有非小细胞肺癌或者是否存在患有非小细胞肺癌的风险，从而指导临床医师给予其预防方案或者治疗方案。因此，检测miRNA647表达水平的引物、探针等试剂可以用于制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒
本专利技术属于生物医药检测领域，涉及一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒。
技术介绍
肺癌是目前世界范围内发生率和病死率第一的恶性肿瘤，每年新发患者大约有50万例，尽管近年来在肺癌诊断治疗上有很多的进展，但其5年生存率仅为15％-17％。从组织学上，肺癌分为小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)，所占比例分别为15％和85％。其中非小细胞肺癌大都在晚期才能被发现，其5年生存率不到15％，所以如果可以做到早期诊断，其生存率将会有所提高。现阶段的检测的主要手段是影像学和纤维支气管镜检查，与二者相比，肿瘤标志物检测具有风险小、无辐射、低成本以及简便等优点。MicroRNA(miRNA)是一种大小为19-22个核苷酸的内源性单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，在生物进化过程中高度保守，在细胞中可以特异性表达。miRNA可以通过与目标mRNA特异性碱基互补配对引导沉默复合体(RISC)，降解mRNA或阻遏其翻译，在转录后水平调节相关基因表达，从而在细胞增殖、分化、凋亡等过程发挥重要的作用。研究表明，miRNA与肿瘤密切相关，在肿瘤的发生或发展过程中常常伴随着染色体的缺失或者扩增，从而导致癌基因的激活或者抑癌基因的失活。研究表明，许多miRNA分子定位在与肿瘤密切相关的染色体变异区内，单一的miRNA能够靶向多个mRNA，从而调节多个蛋白的表达，miRNA表达紊乱是导致一系列肿瘤形成的重要因素。近年来miRNA成为研究热点，研究表明miRNA通过调控靶基因的表达可以影响肿瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡等多种过程。例如，miRNA-124可以通过下调CDK4的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖；miRNA-214通过作用p53使乳腺癌细胞的侵袭能力增强；miRNA-144促进肺癌细胞凋亡。miRNA的异常表达可以诱导与疾病相关基因的表达发生异常，从而诱发肿瘤的发生，因此直接检测miRNA的表达水平可以为肿瘤的临床诊断提供一定的参考，使其在各种肿瘤疾病的临床诊断、治疗以及预后评估方面起着重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种检测非小细胞肺癌的miRNA标志物的应用。本专利技术的另一目的是提供检测该标志物的引物、探针或基因芯片在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。本专利技术的又一目的是提供一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：miRNA647作为检测非小细胞肺癌的miRNA标志物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。检测miRNA647的引物、探针或基因芯片在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。所述的检测miRNA647的引物优选由SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物组成。一种用于制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂的引物，其特征在于由SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物组成。一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，包括上述的引物。所述的试剂盒，优选还包括检测内参基因U6的引物及qPCR的其他常规试剂。有益效果：本专利技术发现了miRNA647表达水平与非小细胞肺癌的发生有关，通过检测血液中miRNA647的表达水平，结合临床症状可以判断其是否患有非小细胞肺癌或者是否存在患有非小细胞肺癌的风险，从而指导临床医师给予其预防方案或者治疗方案。因此，检测miRNA647表达水平的引物、探针等试剂可以用于制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂。附图说明图1miRNA-647的相对表达量具体实施方式实施例11、RNA提取将收集的非小细胞肺癌和健康人的血液样本各35例，使用PAXgeneBloodRNAKit(Qiagen，Gemany)提取血液的RNA，所有步骤按照说明书进行操作，RNA提取后，取1μL用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用Nanodrop2000(ThermoScientific)检测浓度，当260/280比值为2.0时，RNA纯度为100％，260/280比值在1.8-2.0之间，RNA纯度接近于80-90％，可用于反转录。2、引物和探针的设计根据miRBse查询得知miRNA-647和内参U6的基因序列，利用软件Primer5.0设计microRNA的扩增引物。3、实时荧光定量PCR检测miRNA-647的表达(1)反应体系：见下表(2)反应条件：见下表(4)统计学分析根据得到的Ct值，通过2-△△Ct法进行计算miRNA-647在以U6为内参的相对表达水平的数值。根据实时荧光定量PCR结果得到的Ct值，通过2-△△Ct法进行计算miRNA-647在以U6为内参的相对表达水平的数值。结果表明，如图1所示，与健康人的血液相比，非小细胞肺癌血液中miRNA-647的表达水平显著升高。实施例2.灵敏度检测将反转录得到的cDNA按照10的倍比进行稀释，最终稀释到107倍，取不同稀释比例的cDNA按照实施例1的方法做荧光定量PCR，检测miRNA-647能检测到cq值的最大稀释倍数。从下表可以看出，miRNA-647直至稀释至106倍才检测不到cq值。按照100％的逆转录效率换算，cDNA检测miRNA-647的检测限为3.5×10-2ng/μL,说明cDNA灵敏度较高。序列表<110>南京求臻基因科技有限公司<120>一种非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒<160>4<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1tggctgcactcacttcct18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2aaggaagtgagtgcagcc18<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3tgcgggtgctcgcttcggca20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4aacgcttcacgaatttgcgt20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miRNA647作为检测非小细胞肺癌的miRNA标志物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.miRNA647作为检测非小细胞肺癌的miRNA标志物在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。2.检测miRNA647的引物、探针或基因芯片在制备非小细胞肺癌辅助诊断试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的检测miRNA647的引物由SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：段小红，李曼曼，承康平，丁蕊，张磊，王东亮，周启明，
申请(专利权)人：南京求臻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32