一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由：分别用于检测SLCO1B1基因rs2306283位点、SLCO1B1基因rs4149056位点、ApoE基因rs429358位点和ApoE基因rs7412位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成，所述PCR预混反应液包含用于扩增各位点的特异性引物序列组、探针组和PCR反应液，所述特异性引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成。本发明专利技术所述试剂盒用于检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

【技术实现步骤摘要】
一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
人类SLCO1B1基因定位于12号染色体，编码有机阴离子转运多肽OATP1B1。OATP1B1为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，具有介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除的生理功能，在转运他汀类药物中发挥重要的调控作用。研究表明SLCO1B1基因具有遗传多态性，其中388A>G、521T>C是两种常见的单核苷酸多态性，可以形成4种单倍型SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)和SLCO1B1*15(388G-521C)。突变型SLCO1B1基因引起编码的OATP1B1转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起血药浓度上升。ApoE基因定位于第19对染色体，指导合成载脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)，ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，主要在肝脏和脑组织中表达，识别LDL受体和ApoE受体，介导VLDL和IDL的代谢。ApoE基因主要有两种单核苷酸多态性，rs7412(526C>T)和rs429358(388T>C)，可以形成3种单倍型分别是ApoE3(388T-526C)、ApoE2(388T-526T)、ApoE4(388C-526C)。文献报道，ApoE4携带者相比于ApoE2携带者的药物代谢能力较弱。图1是SLCO1B1基因和ApoE基因多态性位点及基因型频率汇总。他汀类药物是目前防治冠心病、脑中风、高血脂等疾病的首选药物。当SLCO1B1基因发生突变时，其转运功能下降，会导致血液中的他汀类药物浓度上升，增加药物的不良反应(如横纹肌溶解症等)；ApoE基因产生变异时，可导致TC、LDL-C水平产生差异，从而对他汀类药物的疗效产生影响。目前临床上主要采取以下四种方式检测SLCO1B1和ApoE基因的多态性：1.PCR-测序法2.高分辨率溶解曲线法3.芯片杂交法4.Taqman-qPCR法PCR-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过Genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组DNA中SLCO1B1和ApoE基因多态性进行检测。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测引物组，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测探针组，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，具体序列如下：内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’SEQIDNO.19野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’SEQIDNO.20突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’SEQIDNO.21。一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒由：分别用于扩增SLCO1B1基因rs2306283、SLCO1B1基因rs4149056、ApoE基因rs429358和ApoE基因rs7412四个位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液的具体组分如下：(1)用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点PCR预混反应液：由权利要求1所述用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点的4个引物、引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示，内控引物、引物序列如SEQIDNO.17～SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组，核苷酸序列如SEQIDNO.19～SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；(2)用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点PCR预混反应液：由权利要求1所述用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点的4个引物、序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.8所示，内控引物、序列如SEQIDNO.17～SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQIDNO.19～SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；(3)用于扩增ApoE基因rs429358位点PCR预混反应液：由利要求1所述用于扩增ApoE基因rs429358位点的4个引物、序列如SEQIDNO.9～SEQIDNO.12所示；内控引物、序列如SEQIDNO.17～SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQIDNO.19～SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；(4)用于扩增ApoE基因rs7412位点PCR预混反应液：由利要求1所述用于扩增ApoE基因rs7412位点的4个引物、序列如SEQIDNO.13～SEQIDNO.16所示，内控引物、序列如SEQIDNO.17～SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQIDNO.19～SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；所述阳性对照品包括：SLCO1B1基因rs2306283位点野生型质粒、SLCO1B1基因rs2306283位点突变型质粒、SLCO1B1基因rs4149056位点野生型质粒、SLCO1B1基因rs4149056位点突变型质粒、ApoE基因rs429358位点野生型质粒、ApoE基因rs429358位点突变型质粒、ApoE基因rs7412位点野生型质粒、ApoE基因rs7412位点突变型质粒及内参基因质粒DNA；所述阴性对照品包含不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。上述方案中，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50～100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nM；用于扩增各位点的不带荧光基团的各引物浓度均为100～400nM，带荧光基团的各引物浓度均为50～100nM；用于内控的引物的浓度均为100～400nM。上述方案中，所述PCR反应液包括PremixqPCRmix和TE缓冲液。上述方案中，所述阴性对照品由PUC-19质粒空载体和TE缓冲液组成。上述人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒在制备用于检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性产品中的应用。采用人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性的检测过程，具体包括如下步骤：(1)采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组，其特征在于，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：用于扩增SLCO1B1基因 rs2306283位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.4所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增SLCO1B1基因 rs4149056位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.8所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增ApoE基因rs429358位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12所示，其中SEQ ID NO.10所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.12所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增ApoE基因rs7412位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.13~ SEQ ID NO.16所示，其中SEQ ID NO.14所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.16所示引物的5’端携带VIC荧光基团；内控引物序列如SEQ ID NO.17~ SEQ ID NO.18所示。...

【技术特征摘要】
1.引物组，其特征在于，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点的特异性引物序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.4所示，其中SEQIDNO.2所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQIDNO.4所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点的特异性引物序列如SEQIDNO.5~SEQIDNO.8所示，其中SEQIDNO.6所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQIDNO.8所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增ApoE基因rs429358位点的特异性引物序列如SEQIDNO.9~SEQIDNO.12所示，其中SEQIDNO.10所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQIDNO.12所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增ApoE基因rs7412位点的特异性引物序列如SEQIDNO.13~SEQIDNO.16所示，其中SEQIDNO.14所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQIDNO.16所示引物的5’端携带VIC荧光基团；内控引物序列如SEQIDNO.17~SEQIDNO.18所示。2.探针组，其特征在于，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，核苷酸序列如SEQIDNO.19~SEQIDNO.21所示，具体形式如下：内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’。3.一种检测试剂盒，包含权利要求1所述引物组和权利要求2所述探针组，其特征在于，所述试剂盒由：分别用于扩增SLCO1B1基因rs2306283、SLCO1B1基因rs4149056、ApoE基因rs429358和ApoE基因rs7412四个位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液的具体组分如下：（1）用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点PCR预混反应液：由权利要求1所述用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点的4个引物、引物序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.4所示，内控引物、引物序列如SEQIDNO.17~SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组，核苷酸序列如SEQIDNO.19~SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；（2）用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点PCR预混反应液：由权利要求1所述用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点的4个引物、序列如SEQIDNO.5~SEQIDNO.8所示，内控引物、序列如SEQIDNO.17~SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQIDNO.19~SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；（3）用于扩增ApoE基因rs429358位点PCR预混反应液：由利要求1所述用于扩增ApoE基因rs429358位点的4个引物、序列如SEQIDNO.9~SEQIDNO.12所示；内控引物、序列如SEQIDNO.17~SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQIDNO.19~SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；（4）用于扩增ApoE基因rs7412位点PCR预混反应液：由利要求1所述用于扩增ApoE基因rs7412位点的4个引物、序列如SEQIDNO.13~SEQIDNO.16所示，内控引物、序列如SEQIDNO.17~SEQIDNO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQIDNO.19~SEQIDNO.21所示，PCR反应液组成；所述阳性对照品包括：SLCO1B1基因r...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宁，付金玲，李倩，李雪梅，叶伦，程弘夏，陈刚，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42