检测NAT2基因多态性的探针组、试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种用于快速检测抗结核药物性肝损伤相关NAT2的基因多态性的探针组、试剂盒和分型检测方法。所述探针组由341位点野生型和突变型探针、481位点野生型和突变型探针、590位点野生型和突变型探针以及857位点野生型和突变型探针组成，所述探针的5′端分别标记有不同的荧光基团，3′端分别标记有相应的荧光淬灭基团。本发明专利技术利用的探针组和试剂盒能够快速、准确、简便地对抗结核药物性肝损伤相关NAT2基因进行分型。

【技术实现步骤摘要】
检测NAT2基因多态性的探针组、试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及用于检测抗肺结核药物性肝损伤相关的NAT2基因多态性(SNP)分型的探针组、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
结核病是由于结核分枝杆菌引发的肺部感染性疾病，根据2012年WHO世界卫生组织，全球约有20亿人感染了结核分枝杆菌，每年新出现肺结核患者约80-100万，若不及时治疗，平均每例结核病患者每年可传染10～15人。到目前为止，肺结核依然是由单一病原菌导致死亡人数最多的疾病，并且随着耐药菌株的出现而呈现死灰复燃之势，因此结核病已成为全世界重要的公共卫生问题，且一直困扰着人类健康。其中95％的结核病例及98％的结核病死亡病例发生在发展中国家，我国结核病疫情同样居高不下，疫情非常严重，全国传染性肺结核患者约100万例，在全球22个结核病高负担国家中名列第二，仅次于印度，占全球所有结核病例15％左右。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染，所以从国家战略层面必需尽快实现对肺结核的有效控制，不然将会导致严重的公共卫生问题和社会问题。目前结核病的治疗主要是应用异烟肼、利福平等药物，尤其是异烟肼(isoniazid，INH)的专利技术使治疗结核病起了根本性的变化。自1952年被用于临床治疗以来，由于异烟肼对结核杆菌选择性高，抗菌能力强，且价格低廉，一直被广泛用作抗结核治疗的一线药物。但INH具有一定的毒副作用，可引发肝脏的严重不良反应，若不当用药，则有一定的致死率。在所有的一线抗结核药物中，异烟肼是引发肝毒性不良反应的主要药物。INH在人体内主要存在两条代谢通路(如下式(1)所示)，其大部分异烟肼在N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase-2，NAT2)的作用下乙酰化为乙酰异烟肼(AcINH)，之后在酰胺酶(amidase)的作用下生成乙酰肼(acetylhydrazine，AcHz)；另外一小部分INH直接由酰胺酶催化水解为肼(hydrazine，Hz)，再由NAT2乙酰化为乙酰肼，其中Hz是构成INH肝毒性的主要物质，可以引起不可逆性肝细胞损伤。如NAT2的催化活性强，则能够抑制Hz的积累，从而减轻Hz的积累导致的肝功能受损，因此NAT2广被关注。NAT2又称芳香胺N-乙酰基转移酶2，由NAT2基因编码，NAT2基因定位于人类8号染色体8p22，主要催化芳香胺进行乙酰化反应。NAT2主要表达于肝脏和肠道，在体内参与致癌性芳香胺和杂环胺类化合物以及异烟肼、普鲁卡因胺和磺胺类等20多种肼类化合物的生物激活或灭活，因此近年来NAT2在药物代谢方面的作用正受到越来越多的重视。早在几十年前，人们就发现该基因的多态性会造成个体间N-乙酰基转移酶2活性的差异，且机体中NAT2功能的变异与异烟肼乙酰化作用的多样性相关。NAT2活性在人群中呈多态分布，研究证实NAT2基因突变可影响NAT2酶的表达、稳定性以及催化活性。NAT2基因存在七个常见的单核苷酸多态性位点，分别是rs1801279(G191A)、rs1041983(C282T)、rs1801280(T341C)、rs1799929(C481T)、rs1799930(G590A)、rs1208(G803A)和rs1799931(G857A)，可组成27个以上的等位基因型，其中*4型为野生型，为正常的快代谢等位基因。481位点单独突变时不会导致氨基酸的变化，形成快代谢等位基因*11；282位点通常与590或857位点联合突变，形成等位基因*6A和*7B；341、481、803位点联合突变形成等位基因*5B(见表1)，其中282和803位点的突变为同义突变，不会导致氨基酸的变化。*5B、*6A、*7B是中国和高加索人中最常见的慢乙酰化表型突变，占所有突变的90％以上，它们是造成NAT2基因多态性的主要原因，可解释98％以上的慢代谢。根据携带的等位基因型对乙酰化表型进行划分，携带两个快代谢等位基因为快代谢型(RM)，携带一个快代谢等位基因和一个慢代谢等位基因为中间代谢型(IM)，携带任意两个慢代谢等位基因为慢代谢型(SM)。SM与INH引发的肝毒性不良反应密切相关，对于SM的结核病患者，由于INH的乙酰化作用减弱，水解作用反而加强，导致大量Hz积累，最终引起肝功能受损。其中*5基因型使NAT2酶催化活性降低92％-99％；*6造成酶催化活性降低58％-81％；而*7导致NAT2酶催化活性降低50％-60％。因此，有必要检测NAT2基因多态性。表1.NAT2基础代谢类型等位基因突变位点代谢类型NAT2*4无快乙酰化型NAT2*11481快乙酰化型NAT2*5B341、481、803慢乙酰化型NAT2*6A282、590慢乙酰化型NAT2*7B282、857慢乙酰化型慢乙酰型的中国人占10-20％，查明患者的快、慢乙酰化基因型有助于对乙酰化代谢相关的药物进行个体化用药或毒性作用的控制，因而在用药前进行NAT2基因多态性的检测具有重要的意义。目前大多文献建议IM患者使用标准剂量；RM患者体内血药浓度降低，有发生INH抵抗的风险，导致治疗无效，因此RM患者使用1.5倍的标准剂量；而对于SM患者，则应使用一半的标准剂量以防止不良反应的发生。目前国内尚没有通过CFDA获批上市的NAT2基因多态性检测试剂盒，现有的文献及研究方法主要为直接测序法、杂交法、PCR-RFLP法、基因芯片法、荧光PCR熔解曲线法等。一般测序法作为基因检测的“金标准”，但由于检测周期长，约需要一周，且过程复杂，操作繁琐，成本高，所以限制了其在临床上的应用。杂交法灵敏度高，但易交叉污染，且PCR扩增产物需要开盖进行后续杂交操作，检测劳动强度大，耗时长，与外界接触容易造成污染。PCR-RFLP法虽然费用较低，但操作复杂，需要PCR后处理，容易引起污染，且特异性和灵敏性较差，检测时间长，约需要2天。基因芯片技术成本高，操作复杂，结果也存在不同程度的假阳性。荧光PCR熔解曲线法，如CN106367489A和CN106119363A中一个位点分别只对应一条探针，特异性差，且需要先进行PCR扩增，扩增后进行熔解曲线分析，耗时长，单探针Tm值变化较小，且需要高分辨率仪器，对仪器要求苛刻。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于快速检测NAT2基因多态性的探针组和试剂盒及其使用方法。本专利技术的第一方面提供一种用于检测NAT2基因多态性的探针组，所述探针组包括341位点野生型和突变型探针、481位点野生型和突变型探针、590位点野生型和突变型探针以及857位点野生型和突变型探针，其中，341位点野生型探针序列如序列号12所示，341位点突变型探针序列如序列号13所示；481位点野生型探针序列如序列号16所示，481位点突变型探针序列如序列号17所示；590位点野生型探针序列如序列号22所示，590位点突变型探针序列如序列号23所示；857位点野生型探针序列如序列号24所示，857位点突变型探针序列如序列号25所示，且所述探针的5′端分别标记有荧光基团，3′端分别标记有相应的荧光淬灭基团。上述探针组中，341位点野生型和突变型探针与481位点野生型和突变型探针混合，590位点野生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测NAT2基因多态性的探针组，其特征在于：所述探针组包括341位点野生型和突变型探针、481位点野生型和突变型探针、590位点野生型和突变型探针以及857位点野生型和突变型探针，其中，341位点野生型探针序列如序列号12所示，341位点突变型探针序列如序列号13所示；481位点野生型探针序列如序列号16所示，481位点突变型探针序列如序列号17所示；590位点野生型探针序列如序列号22所示，590位点突变型探针序列如序列号23所示；857位点野生型探针序列如序列号24所示，857位点突变型探针序列如序列号25所示，且所述探针的5′端分别标记有荧光基团，3′端分别标记有相应的荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测NAT2基因多态性的探针组，其特征在于：所述探针组包括341位点野生型和突变型探针、481位点野生型和突变型探针、590位点野生型和突变型探针以及857位点野生型和突变型探针，其中，341位点野生型探针序列如序列号12所示，341位点突变型探针序列如序列号13所示；481位点野生型探针序列如序列号16所示，481位点突变型探针序列如序列号17所示；590位点野生型探针序列如序列号22所示，590位点突变型探针序列如序列号23所示；857位点野生型探针序列如序列号24所示，857位点突变型探针序列如序列号25所示，且所述探针的5′端分别标记有荧光基团，3′端分别标记有相应的荧光淬灭基团。2.如权利要求1所述的探针组，其特征在于：341位点野生型和突变型探针与481位点野生型和突变型探针混合，590位点野生型和突变型探针与857位点野生型和突变型探针混合，两个混合分开使用。3.如权利要求1或2所述的探针组，其特征在于：所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、CY5.5，所述荧光淬灭基团选自NFQ-BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3或TAMRA。4.如权利要求2或3所述的探针组，其特征在于：341位点和590位点野生型探针的5′端标记荧光报告基团为ROX，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ2，突变型探针的5′端标记荧光报告基团为CY5，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ3；481和857位点野生型探针的5′端标记荧光报告基团为VIC，突变型探针的5′端标记荧光报告基团为FAM，481位点的野生型和突变型探针的3′端标记荧光淬灭基团为BHQ1，857位点的野生型和...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，钟晓玮，苏建臣，韩敏，宋晓强，
申请(专利权)人：北京安百胜诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11