一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及饲料添加剂技术领域，具体涉及一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法；包括将耐高锌植物乳杆菌菌种用于富锌植物乳杆菌添加剂制备的步骤；其中，所述富锌植物乳杆菌添加剂的制备包括以下步骤：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养、乳化、冻干等步骤；本发明专利技术的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，安全可靠、含有有机锌化物、且益生菌生物活性维持较高水平。

【技术实现步骤摘要】
一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法
本专利技术涉及饲料添加剂
，具体涉及一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法。
技术介绍
锌是动物生长必需的微量元素之一，其参与动物机体组成、以酶的活化因子参与体内物质代谢、维持机体正常的生理功能并作为调节因子影响细胞复制和分化。目前，国内饲料中添加的锌主要为氧化锌、硫酸锌等无机形态。这种添加方式存在很多的问题，如动物吸收率低，若增加锌的添加量，不仅增加了粪便中锌的沉积，而且还会给环境造成一定的污染。近些年的大量试验表明，有机态微量元素添加剂，如微量元素氨基酸螯合物，具有容易被动物吸收、毒性小、动物增重明显、生物学效价高等特点，在猪、禽、反刍动物及鱼类等动物上取得了较好的效果。然而，微量元素氨基酸螯合物添加剂，存在生产成本高、制造工艺不完善等问题，难以大规模推广使用。目前在富锌微生物方面研究最多的是酵母菌，然而采用微生物方法进行富锌时，其无机锌的浓度需要控制在一定范围内，否则会影响微生物的生长或导致具有生物活性的酵母菌大量死亡，同时也会影响宿主的健康，即需要在锌的添加量与高富锌量之间达到一个平衡。因而，如何开发出一种安全可靠、含有有机锌化物的益生菌菌粉添加剂，该添加剂具有补锌功效的同时还能保证益生菌的生物活性，成为当前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种安全可靠、含有有机锌化物、且益生菌生物活性维持较高水平的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法。本专利技术的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，包括将耐高锌植物乳杆菌菌种用于富锌植物乳杆菌添加剂制备的步骤；其中，所述富锌植物乳杆菌添加剂的制备包括以下步骤：S2.1、斜面菌种培养：将耐高锌富锌植物乳杆菌菌种划线接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值为5.5-7.0的改良MRS固体培养基上，培养温度35-40℃，厌氧培养36-48h；S2.2、一级液体种子培养：通过灭菌的生理盐水将改良MRS固体培养基上的菌落洗下混匀，吸取2.5ml菌液接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值5.5-7.0的250mL改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，厌氧培养15-24h，得到一级液体种子培养液；S2.3、二级液体种子培养：将200ml一级液体种子培养液接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值5.5-7.0的15-30L改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，转速10-50rpm，培养5-10h，得到二级液体种子培养液；S2.4、发酵罐培养：将20L二级液体种子培养液接种于糖含量2-5％、锌含量20-1000ug/ml、初始pH值5.5-7.0的1000-2000L改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，转速10-50rpm，发酵过程中用碱控制pH5.0-6.5，培养8-16h，得到富锌植物乳杆菌培养液；S2.5、将富锌植物乳杆菌培养液离心收集，得到的菌泥与保护剂进行乳化、冻干，经粉碎得到富锌植物乳杆菌添加剂。经实验证明，经粉碎得到富锌植物乳杆菌添加剂，每千克含锌1000-4000毫克。进一步的，所述耐高锌植物乳杆菌菌种经以下步骤获得：S1.1、将植物乳杆菌采用涂平板的方法接种到含不同锌浓度的改良MRS固体培养基中上，以确定其锌离子的耐受性；S1.2、以确定的锌离子耐受浓度为起始浓度，将植物乳杆菌接种到含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为二代。如此传代驯化培养40-60代；S1.3、将驯化后的菌株进行分离筛选，接种到改良MRS液体培养基中培养，筛选出经过驯化后耐锌能力强的菌种并保藏，即为耐高锌植物乳杆菌菌种；进一步的，步骤S1.1和步骤S1.2中，改良MRS固体培养基和改良MRS液体培养基的糖含量为2-5％、锌含量为20-1000ug/ml、pH值为5.5-7.0、培养温度为35-40℃；改良MRS液体培养基厌氧培养12-24h，改良MRS固体培养基厌氧培养36-48h。进一步的，步骤S1.1中确定植物乳杆菌锌离子耐受性的条件为：培养36-48h后，单菌落直径小于0.5mm对应的锌离子浓度。进一步的，步骤S1.2中同一代的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基中锌含量相同，其中1-15代采用的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基的锌含量为20-300ug/ml，15-35代采用的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基的锌含量为300-600ug/ml，35-50代采用的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基的锌含量为600-1000ug/ml，进一步的，当植物乳杆菌在改良MRS固体培养基上生长36-48h后，当菌落直径在1-2mm时，开始在培养基中提高锌含量；进一步的，步骤S2.4中采用的碱为20-40％的碳酸钠或氢氧化钠。进一步的，步骤S2.5中的保护剂包括海藻糖、蔗糖、甘油中的一种或多种，其中，所述海藻糖的质量分数为10-20％，所述蔗糖的质量分数为2-7％，所述甘油的质量分数为2-5％。进一步的，步骤S2.5中冻干条件包括以下步骤：1)-45℃～-50℃预冻3～4h；2)经过240～360min升温至-25～-15℃后，维持840-960min；3)经过4-6h升温至0-5℃后，维持3-5h；4)经过120～240min升温至10～15℃后，维持120～240min；5)经过60-90min升温至25～28℃后，维持240～360min。进一步的，改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基中，添加的锌为无机锌，所述无机锌包括氧化锌、硫酸盐、碳酸盐或氯化物盐，氮源为酵母浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸粉中的一种或几种，碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或几种。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术的富锌植物乳杆菌添加剂，经试验表明，可以有效促进生长肥育猪的生长，降低料肉比，提高饲料转化率，且可以显著降低生长肥育猪粪便中锌元素排泄量，同时也能发挥益生菌的功效，降低肥育猪粪便中的大肠杆菌数量，调节肠道菌群平衡，从而证明富锌植物乳杆菌添加剂，能促进猪只健康生长，促进家畜与环境保护和谐发展，提高养殖的经济价值。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明如后。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1本专利技术一较佳实施例提供一种耐高锌植物乳杆菌菌种的制备方法，包括以下步骤：1)将植物乳杆菌采用涂平板的方法接种到含不同锌浓度的改良MRS固体培养基中上，以确定其锌离子的耐受性；2)以确定的锌离子耐受浓度为起始浓度，将植物乳杆菌接种到含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入含锌离子的改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：包括将耐高锌植物乳杆菌菌种用于富锌植物乳杆菌添加剂制备的步骤；其中，所述富锌植物乳杆菌添加剂的制备包括以下步骤：S2.1、斜面菌种培养：将耐高锌富锌植物乳杆菌菌种划线接种于糖含量2‑5％、锌含量20‑500ug/ml、pH值为5.5‑7.0的改良MRS固体培养基上，培养温度35‑40℃，厌氧培养36‑48h；S2.2、一级液体种子培养：通过灭菌的生理盐水将改良MRS固体培养基上的菌落洗下混匀，吸取2.5ml菌液接种于糖含量2‑5％、锌含量20‑500ug/ml、pH值5.5‑7.0的250mL改良MRS液体培养基中，培养温度35‑40℃，厌氧培养15‑24h，得到一级液体种子培养液；S2.3、二级液体种子培养：将200ml一级液体种子培养液接种于糖含量2‑5％、锌含量20‑500ug/ml、pH值5.5‑7.0的15‑30L改良MRS液体培养基中，培养温度35‑40℃，转速10‑50rpm，培养5‑10h，得到二级液体种子培养液；S2.4、发酵罐培养：将20L二级液体种子培养液接种于糖含量2‑5％、锌含量20‑1000ug/ml、初始pH值5.5‑7.0的1000‑2000L改良MRS液体培养基中，培养温度35‑40℃，转速10‑50rpm，发酵过程中用碱控制pH5.0‑6.5，培养8‑16h，得到富锌植物乳杆菌培养液；S2.5、将富锌植物乳杆菌培养液离心收集，得到的菌泥与保护剂进行乳化、冻干，经粉碎得到富锌植物乳杆菌添加剂。...

【技术特征摘要】
1.一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：包括将耐高锌植物乳杆菌菌种用于富锌植物乳杆菌添加剂制备的步骤；其中，所述富锌植物乳杆菌添加剂的制备包括以下步骤：S2.1、斜面菌种培养：将耐高锌富锌植物乳杆菌菌种划线接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值为5.5-7.0的改良MRS固体培养基上，培养温度35-40℃，厌氧培养36-48h；S2.2、一级液体种子培养：通过灭菌的生理盐水将改良MRS固体培养基上的菌落洗下混匀，吸取2.5ml菌液接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值5.5-7.0的250mL改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，厌氧培养15-24h，得到一级液体种子培养液；S2.3、二级液体种子培养：将200ml一级液体种子培养液接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值5.5-7.0的15-30L改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，转速10-50rpm，培养5-10h，得到二级液体种子培养液；S2.4、发酵罐培养：将20L二级液体种子培养液接种于糖含量2-5％、锌含量20-1000ug/ml、初始pH值5.5-7.0的1000-2000L改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，转速10-50rpm，发酵过程中用碱控制pH5.0-6.5，培养8-16h，得到富锌植物乳杆菌培养液；S2.5、将富锌植物乳杆菌培养液离心收集，得到的菌泥与保护剂进行乳化、冻干，经粉碎得到富锌植物乳杆菌添加剂。2.根据权利要求1所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：所述耐高锌植物乳杆菌菌种经以下步骤获得：S1.1、将植物乳杆菌采用涂平板的方法接种到含不同锌浓度的改良MRS固体培养基中上，以确定其锌离子的耐受性；S1.2、以确定的锌离子耐受浓度为起始浓度，将植物乳杆菌接种到含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为二代。如此传代驯化培养40-60代；S1.3、将驯化后的菌株进行分离筛选，接种到改良MRS液体培养基中培养，筛选出经过驯化后耐锌能力强的菌种并保藏，即为耐高锌植物乳杆菌菌种。3.根据权利要求2所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：方曙光，严涛，姜甜，朱建国，
申请(专利权)人：江苏微康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32