一种乳酸细菌菌种保藏方法技术

本发明专利技术公开了一种乳酸细菌菌种保藏方法，属于菌种保藏领域，以解决现有方法存在的无法再次长期保藏的问题。包括（1）配制乳酸细菌菌种保藏培养基；（2）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备；（3）乳酸细菌菌体收集；（4）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂；（5）乳酸细菌菌体包埋粒制备；（6)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏。本发明专利技术具有保藏乳酸细菌菌种适用范围广、存活率高、保藏期长、携带方便、复苏简便，保藏乳酸细菌菌种活化传代后，可继续保藏重复使用的优点。本发明专利技术有效保证了乳酸细菌菌种保藏时的存活数量，保藏方法简便易行，经济适用，也可供其它细菌保藏参考使用。

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸细菌菌种保藏方法
本专利技术属于菌种保藏领域，具体涉及一种乳酸细菌菌种保藏方法。
技术介绍
乳酸细菌是能利用可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的一类细菌。这类细菌在自然界分布广泛，种类繁多，它们是研究分类、生物化学、遗传学、分子生物学、基因工程的理想材料，在科研理论上具有重要意义，在工业、农牧业、食品和医药保健等与人类生活密切相关的重要领域中也具有极高的应用价。微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。乳酸细菌与其它微生物一样，菌种保藏就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌，能够长期在研究、生产上应用。为了能较长期地保持菌种的特性，防止菌种的衰退和死亡，人们创造了许多保藏菌种的方法，常用的菌种保藏方法有：定期移植保藏法，石蜡油封藏法，沙土保藏法，真空冷冻干燥保藏法和液氮低温保藏法等。目前生产或研究日常使用中乳酸细菌菌种保藏方法主要采用试管定期移植保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，缺点是保藏时间较短，保藏的菌种稳定性不好，易发生变异和退化，携带不方便等；长期保存采用真空冷冻干燥保藏法、液氮低温保藏法，但液氮低温保藏法维护成本较高，真空冷冻干燥保藏法需要特殊设备，且菌种在活化过程中为一次性开启，使用完毕后，无法再次长期保藏。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种一种乳酸细菌菌种保藏方法，以解决现有方法存在的无法再次长期保藏的问题。本专利技术技术方案如下：一种乳酸细菌菌种保藏方法，包括下列步骤：（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备：A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；（2)乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000r/min—9000r/min、离心时间为10分钟—30分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在109CFU/mL—1011CFU/mL乳酸细菌菌悬液；（4）乳酸细菌菌体包埋粒制备：将添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5分钟—30分钟，制备出乳酸细菌保藏菌种包埋粒，包埋粒直径为1mm—3mm，包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1；包埋材料溶液占50—90份，添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液占10—50份，固化剂为0.1mol/L—1mol/L灭菌氯化钙溶液；（5)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏：将乳酸细菌保藏菌种菌体包埋粒加入灭菌甘油进行混合，甘油体积比浓度为25%—45%，-70℃—4℃低温保存。作为本专利技术的进一步改进，所述乳酸细菌为乳酸杆菌，其保藏培养基组成和重量配比为，蛋白胨5—10份、牛肉浸粉3—8份、酵母浸粉2—6份、葡萄糖5—20份、磷酸氢二钾1—2份、柠檬酸氢二铵1—2份、乙酸钠3—5份、硫酸镁0.1—0.2份、硫酸锰0.02—0.04份、碳酸钙10—20份、吐温-801—2份和水1000份，pH值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌15—20分钟，备用。作为本专利技术的进一步改进，所述乳酸细菌为乳酸球菌，其保藏培养基组成和重量配比为，大豆胨3—5份、蛋白胨2.5—5份、酪蛋白胨2.5—5份、酵母浸粉2—3份、牛肉浸粉3—5份、乳糖3—10份、抗坏血酸钠0.3—0.5份、甘油磷酸钠15—20份、硫酸镁0.2—0.3份、碳酸钙10—20份和水1000份，pH值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌15—20分钟，备用。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤（3）中冷冻保护剂的组成和重量配比为，脱脂牛奶或脱脂奶粉5—30份、葡萄糖0.5—5份、抗坏血酸0.1—1份和蒸馏水100份。本专利技术根据乳酸细菌菌种的生理、生化特性，在人为创造的条件下尽量降低细胞的新陈代谢，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，并减低菌种的变异率，保证在贮藏期内有足够的活细菌数，创造有利于乳酸细菌保藏的一些方法措施，为乳酸细菌保藏提供一条新的途径，解决乳酸细菌在日常使用和长期保存保藏中存在的一些问题。本专利技术通过对乳酸细菌普通培养或高密度培养后进行菌体收集，包埋，加入甘油进行低温保藏。本专利技术方法包埋粒中乳酸细菌总活菌数大于1×109CFU/g，本专利技术的保藏方法具有保存期长，复苏简便，可重复多次使用优点。在4℃保藏期为1年，在-20℃保藏期为3年，在-70℃以下保藏期为5年。本专利技术的保藏方法乳酸细菌保藏菌种包埋粒复苏传代后，包埋粒可以继续低温保藏，乳酸细菌保藏菌种在保藏过程中使用方法简便，可反复活化保藏使用5代，适用范围广、存活率高、保藏期长、复苏简便、携带方便等优点，可适用于科研和生产的日常保存和长期保存。本专利技术有效保证了乳酸细菌菌种保藏时的存活数量，保藏方法简便易行，经济适用，也可供其它细菌保藏参考使用。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但是这些实施例，不用来限制本专利技术的范围。实施例中的乳酸细菌是现有的。实施例1：配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉2g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、碳酸钙20g、吐温-802g和水1000g，pH值7.0，121℃加压蒸汽灭菌15分钟，备用。德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）培养物的制备，将德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种接入乳酸杆菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，37℃培养24h后，终止培养。将德氏乳杆菌保加利亚亚种培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000r/min，离心时间为15分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/10保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶30g、葡萄糖5g、抗坏血酸0.5g和蒸馏水100g，将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。称取食用明胶，加入加热至75本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于包括下列步骤：（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备： A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18 h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36 h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；（2) 乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 分钟—30 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在109 CFU/mL—1011 CFU/mL乳酸细菌菌悬液；（4）乳酸细菌菌体包埋粒制备：将添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5 分钟—30 分钟，制备出乳酸细菌保藏菌种包埋粒，包埋粒直径为1 mm—3 mm，包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1；包埋材料溶液占50—90份，添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液占10—50份，固化剂为0.1 mol/L—1 mol/L灭菌氯化钙溶液；（5)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏：将乳酸细菌保藏菌种菌体包埋粒加入灭菌甘油进行混合，甘油体积比浓度为25%—45%，‑70℃—4℃低温保存。...

【技术特征摘要】
1.一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于包括下列步骤：（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备：A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；（2)乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000r/min—9000r/min、离心时间为10分钟—30分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在109CFU/mL—1011CFU/mL乳酸细菌菌悬液；（4）乳酸细菌菌体包埋粒制备：将添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5分钟—30分钟，制备出乳酸细菌保藏菌种包埋粒，包埋粒直径为1mm—3mm，包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵建宁，彭章普，刘彩云，麻和平，张文齐，王洁，
申请(专利权)人：甘肃省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62