本发明专利技术公开了一种鼠李糖乳杆菌LRa05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.12734；对志贺氏菌具有良好的拮抗作用，其拮抗能力优于普通常用的乳杆菌和商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG；并且具有良好的耐酸、耐胆盐的特性；鼠李糖乳杆菌LRa05制备的保健食品，其动物试验及人体试验结果表明，可有效缓解志贺氏菌引起的腹痛、腹泻、发烧等症状；另外，鼠李糖乳杆菌属于益生菌，已纳入可应用于食品名单目录中的安全菌株，安全性优异，可替代传统抗生素使用。
【技术实现步骤摘要】
一种拮抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05、筛选方法及其应用
本专利技术涉及微生物
，特别涉及一种拮抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05、筛选方法及其应用。
技术介绍
志贺氏菌属(ShigellaCastellani)是一类革兰氏阴性短小杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，属于肠杆菌科，分4个群：痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。无芽胞，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛。是人和灵长类动物的肠道致病菌，引起细菌性痢疾。每年全球感染志贺氏菌的人数高达2亿，每年有上百万的人需要住院治疗，其中很大部分的致死病例发生在发展中国家。每年可导致多达五十万人死亡。志贺氏杆菌导致的痢疾主要是由于肠道上皮粘膜被破坏(特别是盲肠和直肠)。一些系可以产生肠毒素和志贺氏毒素，与大肠杆菌细菌外毒素类似，最常见的症状是腹泻(水腹泻)、发烧、恶心、呕吐、胃抽筋、肠胃气胀和便秘。一般针对志贺氏菌所引起的病症，主要是采用抗生素来进行治疗，如氨苄青霉素、氯霉素等，但是采用抗生素，极易导致志贺氏菌产生抗药性，破坏正常的肠道菌群平衡，而且随着抗生素的滥用会产生的“超级细菌”，其抗生素的使用越来越受到人们的重视及慎用。肠道微生态疗法是最近许多研究学者所进行研究的一个热点，尤其是对乳酸菌的研究。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵传统食品及人肠道中，乳酸菌能调节肠道菌群平衡，控制内毒素，抑制肠道内致病菌的的生长繁殖，从而对机体的营养状态、生理功能、药物效应、免疫反应等产生有益的影响，其属于肠道中的有益菌，拮抗其它致病菌的生长，无毒副作用，不产生耐药性，但由于不同菌株之间其生理生化特性、抑菌特性不相同，目前暂时还没有专门针对拮抗志贺氏菌的乳酸菌的筛选、鉴定及其应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种拮抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05、筛选方法及其应用。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供本一种抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌，命名为LRa05，已于2020年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC1.12734，分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步地，所述鼠李糖乳杆菌LRa05的16SrRNA基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示。进一步地，所述鼠李糖乳杆菌LRa05的pheS基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示。所述鼠李糖乳杆菌LRa05的菌株特征为：革兰氏阳性菌，杆状，成链状，无鞭毛，无荚膜，不运动，兼性厌氧菌，最适温度一般是30-40度，菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑不透明，边缘整齐。本专利技术的另一个目的是提供抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05的筛选方法，依次通过样品的采集、分离、纯化、鉴定、保存等试验，最终筛选出拮抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05。具体包括如下步骤：样品采集，先将从采集的传统发酵食品做前处理，取25mL的样品加入至225mL的灭菌生理盐水中，充分混匀，得到菌悬液；菌株的分离，将菌悬液进行10倍梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6后，涂布于含有放线菌酮(10-50ug/g，OXID公司)和万古霉素(20-50ug/g，浙江海正药业股份有限公司)的MRS琼脂平板培养基上，MRS琼脂平板培养基表面有碳酸钙浇注，于30-37℃厌氧培养48-72h；挑取溶钙圈较大的菌落，接入TPY的增菌液体培养基中(其中含胆盐浓度0.1-0.3％)，30-37℃厌氧培养12-48h；将第二步培养好的、菌浓度(OD600)较高的菌落液体培养基，采用牛津杯法，进行拮抗志贺氏菌的的抑菌试验，30-37℃厌氧培养12-48h挑取抑菌圈最大的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，于30-37℃厌氧培养48-72h。菌株的纯化，挑取培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，30-37℃厌氧培养48-72h；连续划线培养三次，获得纯种鼠李糖乳杆菌LRa05；菌株的鉴定，将鼠李糖乳杆菌LRa05进行革兰氏染色、显微镜下观察，结果显示菌株为革兰氏阳性、杆状菌株，通过将其送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行16SrRNA基因序列和pheS基因序列的鉴定，鉴定结果显示该菌株属于鼠李糖乳杆菌。菌株的保存，将菌落培养物物置于无菌的20％甘油中于-80℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。进一步地，所述MRS琼脂平板培养基组成为：蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、葡萄糖20.00g、吐温-801mL、磷酸氢二钾2.00g、硫酸锰0.58g、硫酸镁0.28g和1L蒸馏水，pH值为6.4±0.1。进一步地，所述TPY增菌培养基组成：水解酪蛋白胨10.0g、大豆胨5.0g、酵母粉2.0g、葡萄糖5.0g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾2.0g、氯化镁0.5g、硫酸镁0.25g、氯化钙0.15g、氯化铁0.000001g、吐温801.0g和1L蒸馏水，pH值为4.5±0.5。本专利技术另一个目的是提供了鼠李糖乳杆菌LRa05抗志贺氏菌的应用，具体为所述鼠李糖乳杆菌LRa05在保健食品中的应用。进一步地，所述保健食品的组成为：按照质量百分比计算，鼠李糖乳杆菌LRa052-5％，植物乳杆菌1-4％，嗜酸乳杆菌1-5％，乳双歧杆菌0.5-3％，副干酪乳杆菌0.5-5％，菊粉20-50％，聚葡萄糖20-60％。优选的，所述保健食品的组成为：按照质量百分比计算，鼠李糖乳杆菌LRa054％，植物乳杆菌1％，嗜酸乳杆菌2％，乳双歧杆菌1％，副干酪乳杆菌2％，菊粉30％，聚葡萄糖60％。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有如下优点和有益效果：本专利技术提供的鼠李糖乳杆菌LRa05，对志贺氏菌具有良好的拮抗作用，其拮抗能力优于普通常用的乳杆菌和商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG；具有良好的耐酸、耐胆盐的特性；鼠李糖乳杆菌LRa05制备的保健食品，动物试验及人体试验结果表明，可有效缓解志贺氏菌引起的腹痛、腹泻、发烧等症状；另外，鼠李糖乳杆菌属于益生菌，已纳入可应用于食品名单目录中的安全菌株，安全性优异，可替代传统抗生素使用。附图说明图1鼠李糖乳杆菌LRa05的形态学特性的镜检图图2鼠李糖乳杆菌LRa05的菌落形态特征图具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种拮抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05，其特征在于，鼠李糖乳杆菌LRa05的拉丁文名称为Lactobacillus rhamnosus LRa05，于2020年7月20日保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.12734。/n
【技术特征摘要】
1.一种拮抗志贺氏菌的鼠李糖乳杆菌LRa05，其特征在于，鼠李糖乳杆菌LRa05的拉丁文名称为LactobacillusrhamnosusLRa05，于2020年7月20日保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC1.12734。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LRa05，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌LRa05的16SrRNA基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示。
3.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LRa05，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌LRa05的pheS基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示。
4.一种根据权利要求1-3任一所述的鼠李糖乳杆菌LRa05的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
样品采集，采集样品进行前处理，取25mL的样品于225mL的灭菌生理盐水中，充分混匀，得到菌悬液；
菌株的分离，将菌悬液进行10倍梯度稀释，分别涂布于含有放线菌酮和万古霉素的表面浇注有碳酸钙的MRS琼脂平板培养基上，于30-37℃厌氧培养48-72h，观察溶钙圈大小；挑取溶钙圈较大的菌落，接入TPY增菌液体培养基中，30-37℃厌氧培养12-48h；测量菌液浓度；选取浓度较大的菌液，采用牛津杯法，进行拮抗志贺氏菌的的抑菌试验，30-37℃厌氧培养12-48h，观察抑菌圈大小；挑取抑菌圈最大的菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，于30-37℃厌氧培养48-72h；
菌株的纯化，挑取培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，30-37℃厌氧培养48-72h；重复划线...
【专利技术属性】
技术研发人员：方曙光，严涛，陈珂可，朱建国，冯胜鹏，程文，
申请(专利权)人：江苏微康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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