一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用，涉及芽孢杆菌发酵技术领域，发酵工艺包括如下步骤：将凝结芽孢杆菌种子液接种至基础培养基中，40‑45℃，150‑250rpm条件下，培养20‑30h；其间，在所述凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的对数期中期添加氨基酸类物质；在凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的稳定期添加醇类物质。本发明专利技术通过对基础培养基进行优化，优化碳、氮比，确保菌株在最适的培养基环境中生长，多代谢多肽类物质。抑菌多肽含量由原来的1710μg/mL提高至3940μg/mL，抑菌活性物质主要为蛋白类的细菌素，安全无毒，可以应用于食品防腐剂，保鲜剂或医药保健领域。

【技术实现步骤摘要】
一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用
本专利技术涉及芽孢杆菌发酵
，特别涉及一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用。
技术介绍
乳酸菌的代谢产物有乳酸、有机酸、不饱和脂肪酸和细菌素等，可抑制某些病原微生物的生长，对宿主有益生作用。但乳酸菌抗逆性较差，对酸、胆盐敏感；抗生素对某些致病菌具有很好的抑菌效果，能减少于某些疾病的发生，但是由于抗生素的滥用，造成某些微生物产生耐药性，形成“超级细菌”，更难防治。凝结芽孢杆菌又称为芽孢乳酸菌，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，能产生芽孢，抗逆性强，其芽孢在100℃高温下10min存活率能达到96.4％；在pH2.0的酸性条件下，6h存活率达到48.2％；在0.9％胆盐条件下24h存活率达78.3％。又能产生乳酸、细菌素等抑菌物质，2016年被国家收录于可用于食品菌株名单目录当中，其安全性有保障，不产生耐药性。但是凝结芽孢杆菌产生的抑菌物质受培养基成份、生长条件的影响，其含量较低，缺乏高抑菌的凝结芽孢杆菌相关成熟产品。提高凝结芽孢杆菌的抑菌活性物质的产量，制备成相应产品，促进其广泛应用有极大的必要性。授权公告号为：CN106191178B，名称为：一种凝结芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法的专利技术专利公开了提高凝结芽孢杆菌多肽类抑菌物质的培养基成份，但没有具体提到菌体在发酵过程中的优化控制。
技术实现思路
本专利技术提供一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用，解决现有的凝结芽孢杆菌抑菌代谢产量普遍偏低的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，包括如下步骤：将凝结芽孢杆菌种子液接种至基础培养基中，40-45℃，150-250rpm条件下，培养20-30h；其间，在所述凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的对数期中期添加氨基酸类物质；在凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的稳定期添加醇类物质。优选的，所述基础培养基包括糖蜜10-40g/L、酵母浸粉10-30g/L、玉米浆干粉5-30g/L、牛肉浸粉10-30g/L、氯化钠1-10g/L、乙酸钠2-10g/L、硫酸镁0.1-1g/L、硫酸锰2-15mg/L和吐温800.5-2g/L。优选的，所述基础培养基包括糖蜜40.00g/L、酵母浸粉20g/L、玉米浆干粉10g/L、牛肉浸粉20g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰10mg/L和吐温802g/L。优选的，所述基础培养基pH为7.0。优选的，步骤(1)中接种量是以2-7mL种子液/100mL基础培养基进行接种。优选的，所述凝结芽孢杆菌种子液是以将凝结芽孢杆菌单菌落接种到PCA液体培养基，40-45℃，150-200rpm，培养20-30h获得。优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌BC99，所述凝结芽孢杆菌BC99命名为凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans，保藏编号为：CGMCCNo.19487。优选的，所述氨基酸类物质为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一种或多种。优选的，所述醇类物质为乙醇、乙二醇或正丁醇中的一种或多种。一种所述的凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺的应用，其特征在于：将通过凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺制备得到的凝结芽孢杆菌的抑菌多肽物质应添加于食品、保健品、添加剂或防腐剂内。采用上述技术方案，本专利技术通过对基础培养基进行优化，优化碳、氮比，确保菌株在最适的培养基环境中生长，多代谢多肽类物质；抑菌的多肽类物质主要成份单体是氨基酸，通过添加特定氨基酸作为多肽合成的前体物质，在菌体生长的特定时候添加，促进多肽抑菌物质的产量最大化提升；菌体产生的多肽类物质，在生长的对数期末期或者稳定期，由于营养物质消耗殆尽，菌体会产生分解多肽物质的酶，将其分解成氨基酸，供菌体生长，因此通过添加特定物质，阻止酶类分解代谢出来的抑菌多肽，确保抑菌多肽类物质产量不下降。本专利技术通过对培养基的优化筛选及发酵工艺的优化，使得凝结芽孢杆菌产生抑菌多肽含量提升2倍，进行以金黄色葡萄糖作为指示菌，测定抑菌效价，其抑制效果与抗生素作效果相当，其抑菌物质主要为蛋白类的细胞素类物质，经过抑菌效价的测定，发现含有3940μg/mL抑菌多肽发酵液的抑菌效价效果与同等抑菌效价的0.6mg/mL的氨苄青霉素以及0.06mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相当，安全无毒副作用，不产生耐药性，在食品防腐及食品、保健品领域有良好的作用效果。附图说明图1为不同碳源对凝结芽孢杆菌BC99的抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图2为糖蜜添加量对凝结芽孢杆菌BC99的抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图3为不同氮源对凝结芽孢杆菌BC99的抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图4为吐温与乙二醇对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图5为温度对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图6为在不同生长时期添加氨基酸对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图7为在不同生长时期添加醇类物质对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；图8为不同pH值对代谢产物抑菌能力的影响图；图9为不同温度对代谢产物抑菌能力的影响图；图10上清液和菌体对代谢产物抑菌能力的影响图；图11不同酶对抑菌物质抑菌能力的影响图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1基础培养基的优化确定1、碳源种类影响配制对照组基础培养基：将蛋白胨20.00g、葡萄糖20.00g、氯化钠5g、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g和硫酸锰10mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至7.0，待用；配制PCA培养基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.0，待用；配制实验组基础培养基：分别以乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、糖蜜替代对照组基础培养基中的葡萄糖，添加量均为20gL，其余参数不变，配制待用；挑取凝结芽孢杆菌BC99单菌落接种至PCA培养基中，42℃，180rpm培养24h获得凝结芽孢杆菌BC99种子液，再将凝结芽孢杆菌BC99种子液分别接种至对照组基础培养基、实验组基础培养基中，42℃，180rpm条件下，培养24h，得到发酵液。其中，凝结芽孢杆菌BC99保藏单位代码：CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，其特征在于：包括如下步骤：/n将凝结芽孢杆菌种子液接种至基础培养基中，40-45℃，150-250rpm条件下，培养20-30h；其间，在所述凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的对数期中期添加氨基酸类物质；在凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的稳定期添加醇类物质。/n

【技术特征摘要】
1.一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，其特征在于：包括如下步骤：
将凝结芽孢杆菌种子液接种至基础培养基中，40-45℃，150-250rpm条件下，培养20-30h；其间，在所述凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的对数期中期添加氨基酸类物质；在凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的稳定期添加醇类物质。


2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，其特征在于：所述基础培养基包括糖蜜10-40g/L、酵母浸粉10-30g/L、玉米浆干粉5-30g/L、牛肉浸粉10-30g/L、氯化钠1-10g/L、乙酸钠2-10g/L、硫酸镁0.1-1g/L、硫酸锰2-15mg/L和吐温800.5-2g/L。


3.根据权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，其特征在于：所述基础培养基包括糖蜜40.00g/L、酵母浸粉20g/L、玉米浆干粉10g/L、牛肉浸粉20g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰10mg/L和吐温802g/L。


4.根据权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，其特征在于：所述基础培养基pH为7.0。


5.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：方曙光，严涛，陈珂可，朱建国，冯胜鹏，程文，
申请(专利权)人：江苏微康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32