一种重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得到以包涵体形式存在的重组蛋白；所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚。该制备方法能够使菌体在自然条件下自行破碎，其不仅可以使得到的包涵体的蛋白完全不受外力的破坏，而且还可以使菌体的破碎率达到95%。

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白的制备方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种重组蛋白的制备方法。
技术介绍
目前，重组蛋白一般是通过对大肠杆菌等表达工程菌株进行发酵培养和诱导表达而获得的。其中，传统重组蛋白的制备方法，往往需要通过超声破碎机或高压匀浆机等菌体破碎设备对发酵诱导后的菌体进行破碎，才能获得以包涵体形式存在的重组蛋白。然而，传统重组蛋白的制备方法得到的包涵体存在破碎率较低的问题，而且由于受外力影响，其还存在蛋白容易被损坏的问题，因此，目前亟待寻找一种新的重组蛋白的制备方法。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种重组蛋白的制备方法，旨在解决
技术介绍
中提出的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得到以包涵体形式存在的重组蛋白；每升所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷10～50mmol、乙二胺四乙酸2～10mmol、聚乙二醇辛基苯基醚0.005～0.02L。作为本专利技术实施例的一种优选方案，所述将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落的步骤，具体包括：将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至(103～104)个/mL后，再涂布于LB固体琼脂培养皿上，并置于35～38℃的恒温条件下进行活化培养，得到活化菌落。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述一级培养的方法包括以下步骤：挑取所述活化菌落接种到LB液体培养基中，并置于35～38℃的温度下进行震荡培养，得到一级种子；所述二级培养的方法包括以下步骤：挑取所述一级种子接种到LB液体培养基中，并置于35～38℃的温度下进行震荡培养，得到二级种子。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，每升所述发酵培养基包括以下组分：甘油5～10g、NaCl5～15g、蛋白胨10～20g、酵母粉10～20g。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液的步骤，具体包括：在35～38℃温度下，将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600为2～10后，再添加诱导剂进行诱导培养，然后降温至4～10℃进行维持培养，得到发酵液。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，发酵培养的溶氧量控制在40％以上。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，冻存的温度为-80～-20℃。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，裂解的温度为15～30℃。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。本专利技术实施例提供的一种重组蛋白的制备方法，无需外用超声破碎机或高压匀浆机等菌体破碎设备，能够使菌体在自然条件下自行破碎，其不仅可以使得到的包涵体的蛋白完全不受外力的破坏，而且还可以使菌体的破碎率达到95％。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1该实施例提供了一种人类胰岛素生长因子1的重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：S1、将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至103个/mL后，再涂布于LB固体琼脂培养皿上，并置于37℃的恒温培养箱中进行活化培养16h，得到活化菌落；其中，表达工程菌株是通过将含有人类胰岛素生长因子1的表达基因的质粒-pET28a(+)-IGF1转入到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到的。S2、挑取生长良好的单个活化菌落接种到50mL的LB液体培养基中，并置于37℃的温度下进行震荡培养7h至OD600约为2，得到一级种子；接着，挑取上述一级种子接种到1L的LB液体培养基中，并置于35℃的温度下进行震荡培养4h至OD600约为2，得到二级种子。S3、在37℃温度下，将二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600为2.8后，再添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并使其浓度达到1mmol/L进行诱导培养4h至OD600为15左右，然后降温至4℃进行维持培养过夜，得到发酵液。其中，发酵培养的溶氧量控制在45％，其pH需通过添加氨水控制在7；每升的发酵培养基包括5g的甘油、5g的NaCl、10g的蛋白胨、20g的酵母粉，发酵培养基的pH为7，其在使用前需要在115℃的温度下进行灭菌20min。S4、将发酵液置于离心机中以6000rpm的转速进行离心处理，收集菌体。S5、将上述菌体置于-80℃的冰箱中进行冻存后，再破碎成1～3cm的小块碎片，并置于15℃的裂解液中进行裂解1h，然后经离心处理，取沉淀，即可得到以包涵体形式存在的重组蛋白。其中，每升所述裂解液包括10mmol的三羟甲基氨基甲烷、2mmol的乙二胺四乙酸和0.02L的聚乙二醇辛基苯基醚，裂解液的pH为7。实施例2该实施例提供了一种表皮生长因子的重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：S1、将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至104个/mL后，再涂布于LB固体琼脂培养皿上，并置于37℃的恒温培养箱中进行活化培养20h，得到活化菌落；其中，表达工程菌株是通过将含有表皮生长因子的表达基因的质粒-pET28a(+)-EGF转入到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到的。S2、挑取生长良好的单个活化菌落接种到50mL的LB液体培养基中，并置于37℃的温度下进行震荡培养7h至OD600约为2，得到一级种子；接着，挑取上述一级种子接种到1L的LB液体培养基中，并置于37℃的温度下进行震荡培养4h至OD600约为2，得到二级种子。S3、在37℃温度下，将二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600为10后，再添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并使其浓度达到1.2mmol/L进行诱导培养5h至OD600为15左右，然后降温至10℃进行维持培养过夜，得到发酵液。其中，发酵培养的溶氧量控制在50％，其pH需通过添加氨水控制在7；每升的发酵培养基包括10g的甘油、15g的NaCl、20g的蛋白胨、10g的酵母粉，发酵培养基的pH为7，其在使用前需要在121℃的温度下进行灭菌30min。S4、将发酵液置于离心机中以6000rpm的转速进行离心处理，收集菌体。S5、将上述菌体置于-20℃的冰箱中进行冻存后，再破碎成1～3cm的小块碎片，并置于30℃的裂解液中进行裂解1h，然后经离心处理，取沉淀，即可得到以包涵体形式存在的重组蛋白。其中，每升所述裂解液包括50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸和0.005L的聚乙二醇辛基苯基醚，裂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；/n将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；/n将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；/n将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；/n将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得到以包涵体形式存在的重组蛋白；每升所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷10~50mmol、乙二胺四乙酸2~10mmol、聚乙二醇辛基苯基醚0.005~0.02L。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；
将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；
将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；
将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得到以包涵体形式存在的重组蛋白；每升所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷10~50mmol、乙二胺四乙酸2~10mmol、聚乙二醇辛基苯基醚0.005~0.02L。


2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落的步骤，具体包括：
将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至(103~104)个/mL后，再涂布于LB固体琼脂培养皿上，并置于35~38℃的恒温条件下进行活化培养，得到活化菌落。


3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述一级培养的方法包括以下步骤：
挑取所述活化菌落接种到LB液体培养基中，并置于35~38℃的温度下进行震荡培养，得到一级种子；
所述二级培养的方法包括以下步骤：
挑取所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周闯，张忠民，
申请(专利权)人：苏州佑宁康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32